p38 MAPK通路蛋白参与IBS-D粪便上清液诱导的Caco-2细胞BDNF过表达为进一步研究PAR-2介导BDNF表达的下游通路,我们检测了MAPK p38和NF-κB p65两个PAR-2受体下游通路蛋白。结果显示IBS-D FSN能够快速诱导p38MAPK磷酸化增加,但对p65蛋白无明显影响。PAR-2抑制剂ENMD-1068可阻断IBS-D
FSN对p38磷酸化的诱导。p38 MAPK抑制剂SB203580可阻断IBS-DFSN对Caco-2细胞BDNF蛋白的上调,但NF-κB抑制剂PDTC则无此作用。5.结直肠灌注IBS-D粪便上清液可诱导C57小鼠结肠高敏感,其作用依赖于结肠PAR-2激活和BDNF的过表达Western blotting结果显示,与对照FSN相比,结肠灌注IBS-D FSN可显著上调小鼠结肠上皮BDNF蛋白的表达,且此作用可被FUT-175和ENMD-1068抑制。免疫组化验证了Western blotting结果,显示上调的BDNF主要分布于结肠上皮和粘膜。功能上,腹壁肌电记录显示结直肠灌注生理盐水和对照FSN对小鼠结肠敏感性没有明显影响,IBS-D Selleckchem NVP-AUY922 FSN可则显著增强小鼠对CRD的腹壁肌电反应。阻断BDNF或PAR-2,以及消除IBS-D FSN丝氨酸蛋白酶活力均显著抑制IBS-D FSN对结肠高敏感的诱导作用。第二部分1.研究对象基本情况连续纳入符合罗马III诊断标准的IBS患者30例和正常对照者30例。IBS患者腹痛程度和腹痛频率评分均显著高于对照组,IBS亚型之间无明显差异。IBS-D患者粪便上清(IBS-DFSN)丝氨酸蛋白酶活力为明显高于正常对照(median (IQR) 1521(905.3-1983) U/mg蛋白vs.465 (264.3-708.0) U/mg蛋白；P
研究背景假体周围炎性骨溶解是人工关节置换术后的严重并发症。目前,大量研究提示无菌性松动主要与假体长期磨损或腐蚀产生的微粒所诱导的生物学反应有关。早在1977年Willert等人首先提出了假体无菌性松动是巨噬细胞对磨损微粒反应的结果。磨损微粒诱导人工关节周围组织内的单核巨噬细胞、成纤维细胞和滑膜细胞释放炎性细胞因子,引起一系列体内持续性炎性反应,促使局部破骨细胞增加,发生骨质吸收破坏,并最终导致假体的无菌性松动。近年来的研究提示,这些炎性细胞因子主要通过骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子(OPG/RANKL/RANK, Osteoprotegerin /Receptor Actibator of Nuclear Factor Kb Ligand /Receptor Actibator of NuclearFactor κB)信号系统激活破骨细胞,导致了假体周围骨量的丢失,产生骨溶解。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis, TWEAK)是1997年新发现的肿瘤坏死因子配体超家族中的一员。TWEAK在人体多种组织中均有表达,是一种广泛表达的肿瘤坏死因子家族的配体。多种免疫细胞(单核-巨噬细胞,树状突细胞,活化的T细胞等)均可产生其可溶性的细胞因子形式。在急慢性炎症或损伤的情况下,TWEAK表达显著增加。已经越来越多研究发现,TWEAK通过与其受体相结合,发挥各种各样的生物学效应,包括释放促炎性因子、调节免疫反应、刺激细胞凋亡以及调节组织修复与再生。TWEAK能促激活经典的核转录因子κB
(Nuclear Factor κ BNF-κB)通路,除此之外,研究发现,TWEAK还可激活非经典的NF-κB通路以及丝氨酸/苏氨酸丝裂原激活蛋白(mitogen-ativated
protein kinase, MAPK)激酶通路。MAPKs信号通路具有生物进化的高度保守性,广泛存在于细胞内,其主要功能是将细胞外刺激信号传递到细胞内,并引起细胞的一系列生物学反应。目前已发现细胞内有多条MAPK通路：细胞外信号调节激酶(extracellular c-Met inhibitor审查 signal regulated kinase, ERK1/ERK2)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)通路(又称为应激活化蛋白激酶stress-activated 已经 protein kinase.SAPK).p38MAPK(p38α, p38β, p38γ and p38δ)通路和ERK3/ERK4/ERK5通路。其中p38 MAPK是MAPK家族的重要成员,当他们受到环境应激或细胞因子刺激时,能使效应细胞产生增殖、分化、迁移、浸润和炎症等生命活动。p38 MAPK的抑制剂SB203580,为吡啶咪唑类衍生物,能特异性地作用于p38 ATP结合活性位点Thr106,使p38失去了与ATP结合的能力,从而使其失去激酶活性。白介素-6(Interleukin 6, IL-6)是一种多功能的细胞因子,主要由单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等分泌,发挥一系列的免疫效应。单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemiattractant protein 1.MCP-1)属于趋化因子超家族的一员,其主要功能是通过趋化作用,使单核细胞离开血流而分化成为分布于组织中的巨噬细胞,参与着机体的免疫和炎症反应。研究表明这些因子都参与着关节置换术后假体周围无菌性松动的病理过程随着对炎性骨溶解研究的深入,特别是在溶骨性因子,受体／配体家族成员及其细胞内信号传导通路对破骨前体细胞分化、成熟及破骨细胞活化、功能影响方面研究的进展,针对骨溶解机制中某一环节进行干预成为可能。目前已有少量文献报道,p38 MAPK信号通道参与了磨损微粒诱导的骨溶解这一病理过程,Zwerina等人通过风湿性关节炎的小鼠模型研究,不仅发现p38MAPK对于炎性骨破坏起着重要作用,同时还发现抑制p38MAPK是减轻炎性骨破坏的重要手段。此外,在临床上对狼疮肾炎、肌炎等疾病的研究中发现,p38 MAPK信号通道能被TWEAK激活,并发挥致病作用。但是p38 MAPK信号通道在人工关节置换术后假体松动的界膜组织中如何表达,尚存在争议。而TWEAK作为TNF配体超家族的成员是否也参与假体周围无菌性松动的发生和发展,尚未见文章报道。基于以上的理论支撑,本研究拟通过组织形态学观察及分子生物学实验方法,探讨人工关节假体周围骨溶解的相关问题。1.在松动假体周围界膜组织中,TWEAK和p38 MAPK表达情况,探讨其表达与假体松动的相关性。2.用钛微粒刺激体外培养巨噬细胞(RAW246.7),通过p38 MAPK抑制剂进行干预,观察TWEAK及p38 MAPK的表达,探讨TWEAK-p38 MAPK信号通过在其中可能的作用机制。3.制备小鼠颅骨骨溶解的动物模型,用p38MAPK抑制剂进行干预,观察TWEAK及p38MAPK的表达,探讨TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信号通道在炎性骨溶解中的作用,以及p38 MAPK抑制剂对人工关节无菌性松动靶向治疗的可能性。一.