7巨噬细胞和人源性的THP-1细胞作为研究对象,运用分子生物学技术,如酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白免疫印迹实验(Western blot)、放射性同位素标记等方法,观察姜黄素对Ox-LDL刺激下巨噬细胞分泌MCP-1和逆胆固醇转运的影响,并探讨其可能的相关机制,进一步揭示姜黄素在心血管药理学方面的分子机制,为姜黄素在心血管疾病治疗上的应用提供理论依据。 研究方法 第一部分姜黄素对Ox-LDL诱导巨噬细胞MCP-1分泌的影响及相关信号通路的研究 1、药物毒性试验 实验分组：1)正常对照组,2)姜黄素5μM组,3)姜黄素10μM组,4)姜黄素20μM组,5)姜黄素40μM组,6)姜黄素80μM组；按分组给予刺激后,于细胞培养箱中干预24h,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞生存活性,目的是排除在实验范围内引起细胞因子分泌水平减少是由于药物引起细胞数量减少所致的可能性,同时寻找合适的药物刺激浓度范围。 2、Ox-LDL对Raw264.7巨噬细胞及THP-1巨噬细胞MCP-1分泌的影响
1、浓度效应：实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (10μg/ml)组,3)Ox-LDL (20μg/ml)组,4) Ox-LDL (40μg/ml)组,5) Ox-LDL (80μg/ml)组,干预24h； 2、时间效应：实验分组：1)0h对照组,2)6h刺激组,3)12h刺激组,4)24h刺激组,均以80μg/ml Ox-LDL干预： 通过ELISA方法检测细胞培养基中MCP-1的浓度。 3、姜黄素对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞及THP-1巨噬细胞MCP-1分泌的影响 实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ivacaftor分子重量 Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(10μM)组,5)Ox-LDL (80μg/ml)＋姜黄素(20μM)组,6) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(40μM)组。
通过ELISA方法检测细胞培养基中MCP-1浓度。 4、不同促分裂原活化蛋白激酶MAPK (Mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路(p38MAPK, JNK,ERK1/2)抑制剂及核转录因子-κB(NF-κB)通路抑制剂对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞MCP-1分泌的影响 实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,2) Ox-LDL (80μg/ml)+SB203580(p38抑制剂)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+SP600125(JNK抑制剂)组,4)Ox-LDL 有 (80μg/ml)+PD98059(ERK1/2抑制剂)组,5) Ox-LDL (80μg/ml)+BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组。 通过ELISA方法对Raw264.7细胞培养基MCP-1进行检测,通过此实验确定OxLDL诱导细胞分泌MCP-1可能被介导的信号通路,为下一步实验提供参考。 5、JNK抑制剂(SP600125)对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞JNK磷酸化的影响 实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+SP600126组。 通过Western blot检测JNK通路磷酸化水平。 6.NF-κB抑制剂(BAY11-7082)对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞核内NF-κBp65表达的影响 实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+BAY11-7082组。 提取核蛋白,通过Western blot检测核内NF-κB p65蛋白水平。 7、姜黄素对Ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞JNK磷酸化和核内NF-κB 那个 p65的影响 实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (80μg/ml)组,3) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(10μM)组,5) Ox-LDL (80μg/ml)＋姜黄素,6) Ox-LDL (80μg/ml)+姜黄素(40μM)。 分别提取细胞蛋白及核蛋白,通过Western blot检测JNK通路磷酸化和核内NF-κB p65蛋白水平。 第二部分姜黄素对Ox-LDL诱导下巨噬细胞逆胆固醇转运的影响及相关机制探讨 1、姜黄素对Ox-LDL诱导下Raw264.7细胞及THP-1巨噬细胞中胆固醇流出率的影响
实验分组：1)对照组,2)姜黄素(5μM)组,3)姜黄素(10μM)组,4)姜黄素(20μM)组,5)姜黄素(40μM)组； 通过放射性同位素标记法来检测各组样品的胆固醇流出率。 2、姜黄素对Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白表达的影响 实验分组:1)对照组,2)姜黄素(5μM)组,3)姜黄素(10μM)组,4)姜黄素(20μM)组,5)姜黄素(40μM)组； 提取蛋白,通过Western blot检测脂质转运相关蛋白表达情况。 3. MAPK通路抑制剂及NF-κB抑制剂对Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞胆固醇流出率的影响 实验分组:1)对照组,2)SB203580(p38抑制剂)组,3)SP600125(JNK抑制剂)组,4)PD98059(ERK1/2抑制剂)组,5) BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组； 通过放射性同位素标记法来检测细胞样品的胆固醇流出率。 4、JNK抑制剂对Ox-LDL诱导下Raw264.7巨噬细胞胆固醇转运相关蛋白表达的影响 实验分组：1)对照组,2)SP600125(10μM)组,3) SP600125(20μM)组； 按分组行不同刺激后,提取细胞蛋白,通过Western blot检测脂质转运相关蛋白表达情况。 研究结果 第一部分姜黄素对Ox-LDL诱导巨噬细胞MCP-1分泌的影响及相关信号通路的研究 1、姜黄素在0-80μM浓度范围内对巨噬细胞生存活性的影响 用不同浓度姜黄素(0,5,10,20,40,80μM)刺激Raw264.