431、74.816和30.440；P值均为0.000),不同时间之间也有显著性差异(F值分别为355.094、356.445和186.168；P值均为0.000),分组因素和时间因素之间存在交互效应(F值分别为51.834、45.956和17.810；P值均为0.000)。并且TAK242显著抑制了MRP8介导的HUVECs通透性增高,而anti-RAGE对MRP8介导的HUVECs通透性增高无影响；对于MRP14而言,anti-RAGE而非TAK242显著抑制了其介导的HUVECs通透性增高；而TAK242和anti-RAGE都可以抑制MRP8/14介导的通透性增高,并且当两种抑制剂合用时,其抑制效果更加显著。 (2)利用Western
Blot检测TAK242和anti-RAGE对MRP8, MRP14和MRP8/14介导p38和ERK1/2磷酸化水平增高的影响。结果显示：当MRP8刺激HUVECs时,各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异(F值分别为49.885和86.672,P值均为0.000),TAK242而非anti-RAGE显著抑制了MRP8介导的p38和ERK1/2磷酸化水平增高；当MRP14刺激HUVECs时,各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异(F值分别为11.023和8.402,P值均为0.000),并且与MRP8刺激不同,anti-RAGE而非TAK242显著抑制了MRP14介导的p38和ERK1/2磷酸化水平增高；当MRP8/14刺激HUVECs时,各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异(F值分别为60.005和46.784,P值均为0.000),而TAK242和anti-RAGE都能抑制MRP8/14介导的p38和ERK1/2磷酸化水平增高,并且当两种抑制剂合用时,其抑制效果更加显著。
很少 以上结果提示：MRP8通过TLR4、MRP14通过RAGE激活p38和ERK1/2信号通路从而介导]HUVECs通透性增高；而MRP8/14既可以通过TLR4又可以通过RAGE介导HUVECs通透性增高。 4. MRPs介导HUVECs通透性增高是Ca2+依赖性的 (1)在有或者无MRP8(2.0μg/ml)的情况下,HUVECs在无Ca2+环境(PBS)中孵育30min,然后加入1.3mM的Ca2+,继续作用60min,测量TER。结果显示,各组之间存在显著性差异(F=136.026,P=0.000),不同时间之间也有显著性差异(F=187.980,P=0.000),而分组因素和时间因素之间存在交互效应(F=101.373,P=0.000)。在无Ca2+条件下不管是否有MRP8刺激,与正常对照组相比,HUVECs通透性都升高,但PBS组与”PBS+MRP8″组相比无显著性差异；当加入1.3mM的Ca2+后,PBS组通透性逐渐恢复,”PBS+MRP8″组HUVECs的通透性非但没有恢复,反而继续升高,与PBS组相比有显著性差异。这些结果表明：在没有Ca2+时,MRP8不能导致HUVECs通透性增加,而在正常Ca2+浓度下,MRP8才能导致HUVECs通透性增高,即MRP8介导的HUVECs通透性增加是Ca2+依赖性的。为了进一步证明MRP8介导HUVECs通透性增加是Ca2+依赖性的,我们先用无Ca2+液体(PBS)处理HUVECs30min,然后用经过浓度梯度Ca2+(0、0.25a、0.5a和a,a=0.37gM,为刚好饱和2.0μg/ml
更多 MRP8钙离子结合位点的Ca2+浓度)孵育的MRP8(2.0μg/ml)刺激60min。结果发现,不同组之间存在显著性差异(F=405.592,P=0.000),不同时间之间也有显著性差异(F=1647.036,P=-0.000),而分组因素和时间因素之间存在交互效应(F=128.156,P=0.000)。在相同浓度MRP8、不同浓度Ca2+刺激下,HUVECs通透性呈Ca2+浓度依赖性的增加。这进一步说明,MRP8介导的HUVECs通透性增加是Ca2+依赖性的。采用相同的方法,我们发现MRP14介导的HUVECs通透性增加也是Ca2+依赖性的。 NVP-BKM120分子重量 (2)另外,我们分别在正常Ca2+浓度和无Ca2+环境中利用MRP8(2.0μg/ml)和MRP14(2.0μg/ml)刺激HUVECs120min, western blotting检测p38和ERK1/2磷酸化水平的变化,结果发现：各组之间p38和ERKl/2磷酸化水平均存在显著性差异(F值分别为47.041和234.488,P值均为0.000),并且在无Ca2+条件下MRP8和MRP14都不能引起p38和ERK1/2磷酸化水平的增高；而在正常Ca2+下,MRP8和MRP14能够引起p38和ERK1/2磷酸化水平显著性增高。 以上结果提示：MRP8和MRP14都以Ca2+依赖性的方式激活p38和ERK1/2信号通路,从而导致HUVECs通透性增高。 结论： 1. MRP8、MRP14和MRP8/14都能够以时间依赖和剂量依赖的方式介导HUVECs通透性增高； 2. MRP8、MRP14和MRP8/14通过激活p38和ERK1/2信号通路介导HUVECs通透性增高； 3.MRP8主要通过TLR4、MRP14主要通过RAGE介导HUVECs通透性增高,而MRP8/14既可以通过TLR4又可以通过RAGE介导通透性增高； 4.