7.统计学分析IRAIN mRNA和IGF-1R mRNA表达与乳腺癌临床病理特征及预后之间的关系。 研究结果： 1．半定量分析表明IRAIN在乳腺癌中广泛表达，表达水平各异。进一步应用实时荧光定量PCR方法对各分子分型乳腺癌及正常乳腺组织中IRAIN mRNA表达进行定量分析，实验结果显示，与正常乳腺组织相比,各分子亚型乳腺癌中IRAIN表达均降低,其中以三阴性乳腺癌降低最为明显，TenofovirHER2阳性型乳腺癌IRAIN表达也明显低于正常乳腺组织，两者差异均有统计学意义（P＜0.05）。Luminal型同样低于正常乳腺组织，但无统计学意义。而对后三者做两两比较，无统计学意义（P＞0.05）。IGF-1R在预后最好的Luminal型中表达最高，与正常乳腺组织接近，而在预后差的TNB型和HER2+型表达明显低于正常乳腺组织及Luminal型，差异有很少统计学意义（P＜0.05）。对TNB型和HER2+型两者做比较，无统计学意义（P＞0.05）。 2.选取IRAIN基因上两个不同位置，在多个乳腺癌患者组织上应用SSRT-PCR方法确定IRAIN转录方向，其结果均是一致的，IRAIN转录方向与IGF-1R mRNA的方向相反，阐明IRAIN为IGF-1R的反义长链非编码RNA。 3．IRAIN在人正常乳腺组织JQ1制造商中呈单等位基因表达，在乳腺癌组织中仍呈单等位基因表达。有趣的是，单等位基因呈不均衡表达，等位基因‘A’优势表达，18例SNP位点为杂合子的患者中，16例表达等位基因“A”，占89%，只有2例表达等位基因“G”占11%，目前还不清楚等位基因“A”的优势表达是否与这种非编码RNA的功能相关。 4．为了确定IRAIN亲本来源即是父源等位基因表达还是母源等位基因表达，我们进行了家系追踪筛查，结果表明IRAIN是父源等位基因表达、母源印记的基因。

第一部分IGFBP7、VEGF、Caspase-3在恶性黑素瘤的表达 目的研究IGFBP7、VEGF、Caspase-3在C57BL／6J荷瘤鼠B16-F10恶性黑素瘤中的表达,探讨IGFBP7作为恶性黑素瘤基因治疗靶点的可能性。 方法培养B16-F1O鼠恶性黑素瘤细胞系,将B16-F10细胞制成细胞悬液注射入C57BL／6J荷瘤鼠背部；待5周Bcompound screening assay16-F10恶性黑素瘤组织形成后,手术取下标本,并用免疫组化检测IGFBP7、VEGF、Caspase-3在上述恶性黑素瘤组织中的表达；分析IGFBP7与VEGF、Caspase-3表达的相关性。 结果培养B16-F1O细胞及构建恶性黑素瘤荷瘤鼠模型成功。病理示肿瘤组织内细胞呈梭形,异形性明显；免疫组化S100在该黑素瘤细胞有中强表达,证实为恶性黑素瘤。IGFBP7在C57BL／6J小鼠皮肤中的表达较荷瘤鼠恶性黑素瘤组织中的表达高(W=261.50,P0.05),实验结果提示pcDNA3.1-IGFBP7质粒可增加I GFBP7mRNA表达且不对β-actin mRNA的表达造成影响。转染了pcDNA3.1-IGFBP7质粒48小时后B16-F1时间0黑素瘤细胞的增殖明显受到抑制(P<0.01)。其抑制增殖效应随pcDNA3.1-IGFBP7质粒浓度的增加而上升,呈剂量浓度依赖性。最大的抑制效应出现在pcDNA3.1-IGFBP7(质粒量为1μg)在转染24小时后,而转染pcDNA3.1-CONTROL及无质粒转染组的细胞增殖差异无显著性；实验结果表明转染pcDNA3.1-IGFBP7可通过增加IGFBP7的合成及分泌抑制B16-F10细胞的增殖。

本部分内容对肉桂酰胺类HDAC抑制剂的5j进行了较为全面的药效学评价及抗肿瘤作用机制研究。结果表明5j能显著抑制HDACl, HDAC8以及Hela细胞核提取物(主要含有HDACl和HDAC2)的酶活性,且活性优于阳性药物SAHA。MTT试验结果表明,5j对多种肿瘤细胞均具有较好的抑制细胞增殖活性,其中对乳腺癌哪里细胞株尤为敏感,因此我们把研究重点侧向于乳腺癌,选择了两种乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7作为进一步的活性及机制研究对象。根据HDACs的功能,我们首先检测了5j对组蛋白乙酰化水平的影响,结果发现5j能显著性提高细胞核中组蛋白4的乙酰化水平,且呈浓度依赖性。另外我们观察了5RGFP966j对细胞周期、细胞凋亡的影响,发现5j主要诱导细胞阻滞于G2期,并能诱导细胞凋亡,且呈一定的浓度依赖性。根据5j对细胞周期、凋亡的影响,我们进一步采用Western blot法检测了5j对细胞周期及凋亡通路密切相关蛋白表达的影响。研究发现5j能浓度依赖性的显著诱导细胞周期抑制因子p21购买GSK2118436WAF1/CIP1的表达。另外,5j能抑制Bcl-2凋亡通路中的Bcl-xL表达,且Caspases通路的Caspase3表达也显著降低。由于Caspase 3在体内需要被激活,分解成两个亚肽起作用,因此我们进一步检测了5j对Caspase 3活性的影响,综合Caspase 3酶原形式蛋白减少与活性增加,说明5j诱导细胞凋亡可能与Caspases细胞凋亡通路有关。

之现113个蛋白与STAT3相互作用,涉及至少23条与肺癌显著相关的生物学过程、分子功能及信号转导通路；将其进行功能聚类后与EML4-ALK融合型肺癌中出现异常表达的基因集求交集(与非ALK融合型非小细胞肺癌比较,ALK融合型肺癌存在83个异常表达基因。见第一部分第二章结果部分),发现STAT3调节的ALK、GHRselleck compound两个分子在EML4-ALK型肺癌中异常表达；STAT3参与调节的Wnt通路在EML4-ALK融合型肺癌中也表达失调。 结论 STAT3通过与ALK的直接相互作用,可能参与EML4-ALK融合型肺癌的发生与增殖；该基因调节的Wnt等信号通路在EML4-ALK融合型肺癌中亦存在异常。这些发现揭已经示了STAT3在EML4-ALK融合型肺癌中的重要作用,有必要对STAT3基因的功能在EML4-ALK融合型肺癌中的作用进行进一步验证。 第二章模式细胞中STAT3的表达对其生物学特性的影响 目的 根据生物信息学分析,STAT3在EML4-ALK融合型肺癌中发挥了重要的信号转导功能。本研究PR-171溶解度应用表达载体介导的RNAi技术及分子克隆技术,构建STAT3干扰或过表达载体并通过在模式细胞中控制该基因表达,探索EML4-ALK融合型肺癌中沉默或上调STAT3信号通路后肿瘤细胞生物学行为的改变。 方法 细胞培养：复苏表达EML4-ALK融合基因的人肺腺癌H2228及EGFR/K-RAS野生型肺腺癌细胞株H1299,并用含10%胎牛血清的RPMI1640传代培养。

结论：对于常规手术、放疗及药物治疗无效的难治性垂体腺瘤,替莫唑胺化疗可能是一种有效替代治疗方法。
目的 胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是最为常见,恶性程度最高的胶质瘤类型。同其他肿瘤一样,GBM的发生、发展以及对各种辅助治疗方式的抵抗与肿瘤细胞内多基因的调节及多种因素相互作用有关。基因治疗被认为是获悉更多各种恶性肿瘤非常有前景的治疗方式,慢病毒载体介导的基因治疗因其较高的转导效率,较好的操控性,既可感染分裂期也可感染非分裂期细胞,并可将外源基因整合入目的细胞基因组中,长期稳定地表达外源基因,是基因治疗中非常有力的工具；慢病毒载体还可介导RNA干扰,从而持续稳定地抑制靶基因的表达。凋亡是一种程序性细胞死亡,并且已得到了非常广泛而深入地研一般究。一般认为坏死是一个不可调控的、非程序性的细胞死亡方式,然而,研究证实,坏死可能至少部分是通过程序调控而形成的,这种细胞死亡被命名为程序性坏死。RIP3,属于RIP家族成员,是Ser/Thr蛋白激酶,因其结构中含有RIP家族同源激酶结构域而得名。RIP3在人体多个正常组织中有表达,而在多种恶性肿瘤细胞系中却表达下降或缺失,研究发现,哪里RIP3是程序性细胞坏死过程中的关键蛋白。GBM的发生、发展以及对放化疗的抵抗与肿瘤细胞凋亡功能失调有重要的关系。虽然凋亡过程有缺陷,几乎所有的GBM均表现出不同程度的瘤内坏死。另外,某些抗肿瘤的辅助治疗方式通过诱导肿瘤坏死对多种恶性肿瘤产生良好的治疗效应。诱导肿瘤细胞坏死从而清除肿瘤细胞在近年来逐渐得到重视。然而,通过诱导肿瘤细胞坏死来治疗恶性肿瘤的研究鲜有报道,且尚未有坏死关键因子RIP3对恶性胶质瘤作用的研究。

运用染色质蛋白免疫共沉淀CHIP技术检测大鼠钠碘同向转运体NIS启动子区域组蛋白不同乙酰化位点乙酰化水平的改变。 结果显示BRAFV600E突变体在PCCL3/BRAF细胞和PCCL3细胞表达时，大鼠钠碘同向转运体NIS基因mRNA表达水平在48h降低了50%到60%。细胞总体组蛋白乙酰化水平略有增加。染色质蛋白免疫共沉淀CHIP结果显示大鼠钠碘同向转运体不NIS启动子区域：PCCL3/BRAF细胞诱导表达BRAFV600E突变时，组蛋白H3K9/14乙酰化位点在P1，P2和P3区域乙酰化水平降低，然而PCCL3细胞瞬时转染BRAFV600E突变时外显子EXON和P1区域H3K9/14乙酰化水平降低。在PCCL3/BRAF细胞中SAHA可以提高大鼠NIS启动子P1, P3，P4和NU不E区域H3K9/14乙酰化水平。在PCCL3/BRAF和PCCL3细胞中，BRAFV600E突变仅影响H3K18和总H4大鼠NIS启动子P1和P2区域乙酰化水平。DOX1ug/ml诱导BRAFV600E突变时，大鼠钠碘同向转运体NIS基因启动子区域P1和P2部分H4K16的乙酰化水平降低，然而细胞核上游增强子NUE区域乙酰化有轻度MLN2238供应商的增高。在PCCL3细胞中瞬时转染BRAFV600E突变体仅降低了大鼠NIS启动子区域P3和P5部分的H4K16位点乙酰化水平。人甲状腺癌细胞BCPAP中，MAPK抑制剂AZD4244，BRAF抑制剂PLX40321um处理细胞48小时，人钠碘同向转运体NIS启动子区域P1部分H3K9/14和H4K16乙酰化水平升高，SAHA提高P1和P2区域H3K9/14乙酰化水平及整个启动子区域的H4K16乙酰化水平。

通过在HEK293病毒包装细胞中扩增最终获得了目的重组腺病毒载体 rAd一MK一TNFa，同时我们通过相同的方法构建了对照空载体病毒、和CMV启动 子启动TNFa的阳性对照病毒，代号分别为ZUCI006、ZUCIO07。通过对三者对 肿瘤细胞系和正常细胞系的不同作用，来比较它们的差别。 实验表明，不同肿瘤对ZUCI008的反应存在着很ROCK 抑制剂s for glaucoma大的不同，有较敏感的细胞 系如HL60，也有极不敏感的细胞系如K562。我们发现ZUCI007和ZUCIO08在 100MOI以匕时对多种肿瘤细胞系均有确切的抑制生长作用，而且呈现一定的量 效关系，其中ZUCI007对成纤维细胞具有明显的抑制作用，P0.5，而ZIJCIOO7和ZUCIO08对Smml7721哪里、RKO细胞贝IJ有 显著的抑制作用，P0.05，说明 TNFa是Z[JCIOOS发挥其抑制肿瘤生长作用的重要因素。比较ZUCIOO7和 ZU C1008对肿瘤细胞的作用发现，ZucI007对HePGZ的抑制作用要显著强于 ZUCI008，而对HL60的抑制作用也强于ZUCI0
在世界范围内食管癌有明显地区而且分布,每年约有三十万新发病例,80%发生在发展中国家。多数食管癌确诊时期别较晚、进展快、死亡率高,目前TNM 分期很难有效预测非手术治疗食管癌的预后,因此探讨准确的预测食管癌预后的生物学指标,制定新的治疗策略与方法显得十分必要。放射治疗在肿瘤治疗中有着非常重要的作用,大部分食管癌患者在治疗过程中需要接受放射治疗,但疗后仍有很大一部分患者不能治愈,放射治疗失败的主要原因是局部复发与远处转移。

6．BSP方法分析富含CpG岛的IRAIN基因启动子区DNA甲基化状态，发现乳腺癌中IRAIN启动子区域甲基化异常，提示DNA甲基化可能参与调控IRAIN基因单等位印记表达及发生印记转换。 7．IRAIN在正常乳腺组织中表达最高，在恶性程度高的三阴性乳腺癌及HER2阳性型乳腺癌显著低表达，提示IRAIN可能作为抑癌基因，调控肿什么瘤细胞生长。IRAIN表达高低与患者月经状态、肿瘤直径、淋巴结转移情况、组织学分级、脉管癌栓及增殖指数无显著相关性。 研究结论： 1．本研究发现全新的位于IGF-1R基因区的长链非编码RNA IRAIN在乳腺癌中广泛表达，IRAIN在正常乳腺组织中表达最高，在恶性程度高的三阴性乳腺癌及HER2阳性型乳也许腺癌显著低表达，提示IRAIN可能作为抑癌基因，调控肿瘤细胞生长。 2．IRAIN转录方向与IGF-1R mRNA的方向相反，是IGF-1R基因的反义长链非编码RNA。 3．IRAIN在人正常乳腺组织及乳腺癌组织中呈单等位基因表达，单等位基因呈不均衡表达，优势表达其中一条等位基因。是父源等位基因表达、和母源印记的基因，与其启动子区DNA甲基化异常有关，是人类基因组为数不多印记基因中新发现的成员之一。 4．首次发现乳腺癌中存在IRAIN等位基因印记转换（allele-switch）现象，这在乳腺癌和其他恶性肿瘤中国内外均未见报道，如果像我们推测的IRAIN作为抑癌基因，那么印记转换很可能是抑癌基因失活的一种全新的方式，正如印记丢失(LOI)在肿瘤中的地位一样，是一种标志性的事件。

作为DNA损伤修复相关基因，其突变导致的蛋白功能缺失将引起细胞癌变，最终导致肿瘤发生。研究发现，APE1基因突变与前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌的发生密切相关。 聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（poly(ADP-ribose) polymerase1，PARP-1）是在高等真核细胞中广泛表达的核酶，参与DNA单链及双链损伤修复。乳腺癌易感基因（BRRaf 抑制剂药剂CA1）在乳腺癌的发生发展中起重要作用。当BRCA1缺陷时，PARP-1的功能对双链断裂修复有着重要的意义。除此之外，PARP-1还可以通过DNA聚合酶（polβ）、DNA连接酶Ⅰ、DNA连接酶Ⅲ/X线交叉互补修复基因（X-ray cross-species complimenting1,XRCC1）XRCC1等介导长补Selleckchem GSK2656157丁BER途径。前期研究发现，PARP-1抑制剂——olaparib可使BRCA1突变的细胞选择性凋亡，但Ⅱ期临床研究却发现，单用奥拉帕尼治疗，有效率仅为41%。 鉴于APE1在DNA损伤修复中的重要作用，本实验研究了APE1的表达与乳腺癌患者病理学特征的相关性。同时作出猜想：APE1可能是BER途径的另一条重要旁路，其介无导的BER途径的激活可能是PARP-1抑制剂靶向治疗三阴性乳腺癌敏感性不高的重要原因。 第一部分乳腺癌组织及细胞中APE1的表达水平及临床意义目的：通过检测乳腺癌组织及细胞中APE1的表达，探讨APE1的表达水平与乳腺癌临床病理参数之间的相关性。方法：收集256例乳腺癌组织及73例非乳腺癌组织（癌旁），制作成组织芯片，利用免疫组织化学方法检测APE1蛋白在组织中的表达，并结合临床病理参数探讨其临床意义。

Real-time PCR等方法检测细胞衰老分泌表型,观察DEX共处理对TIS及SASP的影响,并进一步通过流式细胞分析、成球培养、Western-blot. shRNA等方法来探讨其具体机制。 结果：DEX共处理可以导致PEM的疗效降低,促进肿瘤的侵袭和迁移。DEX共处理可减弱PEM所致的细胞衰老样生长停止,改变肿瘤细胞衰老相关的促炎及促分裂因子分泌表型,即SASP。DEX共处理增加了NSCLC细胞的自我更新、克隆形成等能力,使部分肿瘤细胞出现干性特征。此外,在DEX共处理组Bcl-2表达增加,通过抑制剂ABT737以及shRNA来抑制Bcl-2表达可抑制肿瘤细胞生长和克隆形成能力。 PD0325901半抑制浓度 结论：DEX通过改变SASP抑制PEM的抗肿瘤作用,这是基于Bcl-2依赖方式的肿瘤细胞自我更新能力改变。
脑胶质瘤是一种恶性程度高并且预后差的脑部肿瘤,占脑部全部肿瘤的50%以上。目前脑胶质瘤的标准治疗方法是最大程度的切除肿瘤,然后经过放射治疗,同时辅以替莫唑胺化疗,这样可以显著地增加患者的生存期,但是仍有多于90%的患者复发,并且表现出强烈的放化疗抵抗。为了更好地了解脑胶质瘤放疗抵抗的分子机制,我们按照临床放疗标准对脑胶质瘤细胞T98G单克隆进行gamma射线照射总剂量60Gy后挑选8个放疗抵抗单克隆,采用表达谱芯片和拷贝数变异芯片分别检测照射前后差异表达的基因和CNV片段,比较不同单克隆间差异表达的基因和CNV片段,并结合两种芯片的结果筛选候选基因进行易感性和功能研究。

两种芯片的结果都表现出8个单克隆中差异表达的基因或者CNV片段既有相同的部分,又有各自特异的方面。表达谱结果中差异表达的基因数目最多的单克隆中有3473个差异基因,最少的有168个。CNV芯片的结果中差异CNV片段最多的单克隆中有380个,最少的有235个。分别统计两种芯片中差异基因的数目及出现频率,表达谱数据中总共有4303个差异表达的基因,其中有199个与TCGA数据库中报道的跟生存期相关的基因一致,这些差异的基因在5个以上单克隆中出现的共有4个基因,分别为S100A4、BMP2、LGALS3和NNMT.

有 CNV数据中差异CNV区域包含的基因共有14215个,其中含有最多数目的单克隆中有7274个基因,最少的单克隆中有3103个基因。两种芯片中共同存在的差异基因共有1243个,其中在6个单克隆中都出现的有两个基因(ATP6V1D和SAT1),在5个单克隆中出现的基因有4个,在5个单克隆中出现的基因有13个。 表达谱数据中热图的结果显示,脑胶质瘤细胞8个单克隆可以分为2个大支。GO分析分别统计了每个单克隆中差异最显著的前30个项目,其中在多个克隆中都富集到的项目有溶酶体、ECM与受体相互作用、细胞黏附、Wnt通路、TGF-β通路、乏氧与p53、氨酰-tRNA合成以及谷胱甘肽代谢等,通路分析的结果与GO分析的结果一致。 一般 CNV芯片的LOH结果显示,T98G细胞总共有23个LOH区域,片段大小从3M到108.9M不等,A549细胞总共有21个LOH区域,片段大小从4.2M到95.6M不等。两者共有9个CNV区域相同。与T98G细胞相比,不同单克隆中差异的LOH区域的数目也各不相同,其中相同的片段主要集中在1、7、8和16号染色体。单亲二倍体(UPD)的分析中,我们发现T98G对照细胞在9号和17号染色体存在UPD,但是放射前后没有变化,而A549细胞没有检测到UPD的存在。

基于表达谱芯片和CNV芯片的结果,我们筛选出LGALS3基因作为功能研究的候选基因。LGALS3基因在5个单克隆中表达上调,并且在5个单克隆中拷贝数增加,两种芯片中有3个单克隆中既表达上调,同时又存在拷贝数增加,而且LGALS3的表达量还跟生存期相关,因此被选为候选基因,进行功能研究,由于辐射是脑胶质瘤发生的一个重要的危险因素,因此我们同时研究LGALS3基因的遗传多态性与脑胶质瘤发病风险之间的关系。 LGALS3基因是半乳糖凝集素家族的一员,在细胞间、细胞质以及细胞核内都有表达,参与了细胞不同的生物功能,如增殖、细胞黏附、血管生成和凋亡等,在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用,但是在脑胶质瘤的研究不多。 为了研究LGALS3基因遗传多态是否跟脑胶质瘤的患病风险相关,我们在华东地区收集了961例经神经病理诊断为胶质瘤的病人和1351例的健康对照人群,对LGALS3基因的5个标签SNP位点进行基因分型,探讨LGALS3基因的遗传多态性对脑胶质瘤患病风险的影响。 单位点分析发现,rs4644位点的突变纯合型AA对比于野生型CC可以显著的增加脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR=2.15,95%CI=1.25-3.72, P=0.006。在隐性模型中,AA基因型对比于CC+CA基因型可以显著的增加脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR=2.10,95%CI=1.22-3.62, P=0.007。rs4652位点突变纯合型CC与野生型AA相比能够增加脑胶质瘤的发病风险,校正后的OR=1.29,95%CI=1.00-1.67,但是P值处于临界状态0.054。分层分析中,rs4644位点的AA基因型在男性和GBM中都可以显著的提高脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR值分别为2.07和2.81,95%C1分别为1.04-4.12和1.46-5.38。rs4652位点的CC基因型在女性和GBM中显著的增加患病风险,校正后的OR值分别为1.56和1.44,95%CI分别为1.03-2.37和1.01-2.