2倍,1 h后几乎恢复到正常水平。 2.JNK特异性抑制剂SP-600125呈剂量依赖性的方式抑制AngⅡ诱导的JNK活化和c-Jun磷酸化,当浓度为10μmol/L和20μmol/L时其抑制作用分别达75%和90%,SP-600125对ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均无抑制作用。 3.AngⅡ刺激后c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性显著增加,SP-600125可呈剂量依赖的抑制AngⅡ诱导的c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性的增加,20μmol/L SP-600125预处理几乎完全阻断c-Jun的反式激活。4.AngⅡ显著增加MCP-1启动子活性及MCP-1 mRNA表达,SP-600125可呈剂量依赖性的抑制AngⅡ诱导的MCP-1启动子活化和MCP-1 mRNA表达以及系膜细胞MCP-1、TGF-β和FN的分泌。5.1～20μmol/L SP-600125以剂量依赖的方式抑制AngⅡ促进的系膜细胞~3H-TdR掺入量和细胞计数的增加,而MEK1/2特异性抑制剂PD-98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580对AngⅡ诱导的系膜细胞数目的增加无抑制作用。 结论:AngⅡ→JNK/SAPK→c-Jun/AP-1信号通路在系膜细胞增殖和炎症介质分泌中发挥一定的作用。JNK特异性抑制剂SP-600125能部分抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖和炎症介质分泌。
二、血管紧张素Ⅱ通过ROS/EGFR/JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖 目的:我们前期的研究发现AngⅡ可通过JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖,但JNK/AP-1活化的上游通路尚不清楚。本研究探讨活性氧(ROS)和表皮生长因子受体(EGFR)在AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化及系膜细胞增殖中的作用并探讨ROS释放的来源。 p53-mdm2 interaction 方法:体外培养人肾小球系膜细胞,应用~3H-TdR掺入法和细胞计数测定系膜细胞增殖;荧光探针2,7—二氯二氢荧光素乙酰乙酸(DCFDA)检测细胞内ROS产生;化学发光法检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性;实时定量RT-PCR检测NADPH亚基p47phox和p67phox mRNA表达;Western
Blot检测p47phox和p67phox膜转位以及EGFR、JNK和c-Jun磷酸化。 PI103 结果:1、AngⅡ呈时间依赖性和剂量依赖性促进肾小球系膜细胞ROS产生。AngⅡ刺激3 min,系膜细胞内ROS产生明显增加,至60 min达到高峰,系膜细胞ROS产生是对照组2.26倍;1、10、100nmol/L AngⅡ刺激60 min,ROS产生分别是对照组的1.82、2.92和4.08倍。AT1受体(AT1R)拮抗剂losartan完全阻断了AngⅡ诱导的ROS产生,而AT2受体(AT2R)拮抗剂PD123319无抑制作用。2、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI几乎完全阻断AngⅡ诱导的ROS产生,而线粒体complexⅠ抑制剂鱼藤酮(rotenone,ROT)、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(allopurinol,ALLO)、环氧化酶抑制剂吲哚美辛(indomethacin,INDO)、脂氧化酶抑制剂(nordihydroguiaretic acid,NDGA)、细胞色素P450氧化酶抑制剂酮康唑(ketoconazole,KETO)以及一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-甲酯精氨酸(N~G-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对AngⅡ诱导的ROS产生均无明显影响。AngⅡ显著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜转位。3、AngⅡ可呈时间依赖性和剂量依赖性诱导系膜细胞EGFR磷酸化,100
nmol/L AngⅡ刺激30 min,EGFR磷酸化达到高峰,是对照组的3.96倍;AT1受体阻断剂losartan、抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)以及NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI显著抑制AngⅡ诱导的EGFR磷酸化,同时EGFR拮抗剂AG-1478几乎完全阻断AngⅡ诱导的系膜细胞增殖。4、Losartan、NAC、apocynin、DPI和AG-1478阻断AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化和系膜细胞增殖。 结论:ROS/EGFR/JNK/AP-1信号通路参与AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞增殖。NADPH氧化酶抑制剂和EGFR受体拮抗剂能显著抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖,可能具有一定的治疗作用。 哪里 本研究创新之处在於: 1.首次发现:AngⅡ可通过JNK—c-Jun/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖和MCP-1、TGF-β以及FN表达(参见:Zhang A,Ding G,Huang S,Wu Y,Pan X,Guan X,Chen R,Yang T.c-Jun NH2-terminal kinase mediationof angiotensinⅡ-induced proliferation of human mesangial cells.Am J PhysiolRenal Physiol.2005;288:F1118-1124)。 2.首次发现:活性氧依赖的表皮细胞生长因子受体磷酸化介导AngⅡ诱导JNK—c-Jun/AP-1信号通路活化及肾小球系膜细胞增殖(参见:Ding G,Zhang A,Huang S,Pan X,Zhen G,Chen R,Yang T.ANGⅡinduces c-JunNH2-terminal kinase activation and proliferation of human mesangial cells viaredox-sensitive transactivation of the EGFR.Am J Physiol Renal Physiol.