05);NS1619高剂量组和混合低、高剂量组比较无差异(P＞0.05);尽管TMP高剂量组的细胞存活率低于TMP低剂量组,但是两者间的差异无意义(P＞0.05)。NS1619高剂量组和混合低、高剂量组VSMCs的细胞存活率分别为37.34±6.34%、48.93±7.03%、31.13±5.05%,显著低于其他实验组(P＜0.01),已经表现为较强的细胞的毒性作用。 5 BK_(Ca)通道介导DM大鼠VSMCs凋亡的信号转导机制实验 凋亡率统计结果显示,用低糖(对照组)和高糖培养液(模型组)培养的VSMCs的凋亡率是分别是10.22±0.81%、12.89±2.46%,无差异(P＞0.05)。各实验组与模型组比较:其中NS1619低、高剂量组、TMP组、GSNO和GSNO+paxilline细胞凋亡率显著高于模型组(P＜0.01);GSNO组凋亡率显著高于NS1619组、TMP组(P＜0.01),诱导VSMCs凋亡的作用最强;加入BK_(Ca)通道阻断剂paxilline后,GSNO组的凋亡率下降明显(P＜0.01),但仍高于NS1619低、高剂量组、TMP组(P＜0.01),表明BK_(Ca)通道可能作为一个主要的信号转导通路介导了GSNO诱导VSMCs的凋亡;因凋亡率没有完全降至与模型组相同的水平(P＜0.01),推测GSNO还能通过其他的途径促进VSMCs的凋亡。TMP组的细胞凋亡率与NS1619低剂量组无差异(P＞0.05);NS1619低剂量组的细胞凋亡率低于高剂量组(P＜0.01),表明NS1619可剂量依赖性的增加VSMCs的凋亡。有p38阻断剂SB202190和PKC
inhibitor peptide参与的实验组(SB202190、SB202190+paxilline、PKC inhibitor peptide、PKC inhibitor peptide+paxilline)VSMCs的凋亡率与模型组比较无差异(P＞0.05),表明在本实验中对VSMCs的凋亡无影响,paxilline对p38、PKC的信号转导通路也无影响。 Selleckchem ABT263 结论:本实验通过体内体外用药,从整体水平观察到TMP能降低早期DM大鼠胸主动脉上抑制VSMCs凋亡的c-myc、Bcl-2基因表达、增加促进细胞凋亡的Bax基因表达,其作用呈剂量依赖性;DM早期糖尿病大鼠胸主动脉VSMCs上的BK_(Ca)通道可以代偿性的增加开放,在此基础上TMP还能通过缩短通道的平均关闭时间,增加VSMCs上BK_(Ca)通道开放的概率,TMP的作用呈剂量依赖性。TMP对PDGF-BB诱导的体外培养VSMCs的增殖有一定的抑制作用,并可以通过BK_(Ca)通道介导其凋亡。在DM的早期,TMP通过促进BK_(Ca)通道活动及其他途径介导了VSMCs的凋亡,可以延缓糖尿病血管重构和DA的病情进展,改善血管的功能,达到防治DA的目的;与NS1619相比TMP防治DA的作用靶点多,安全性好,细胞毒性小,可以长期应用;治疗费用低,适用于我国的国情。 TMP通过BK_(Ca)通道介导VSMCs凋亡的可能信号转导路径为: 1 TMP通过BK_(Ca)通道介导VSMCs凋亡信号转导通路 http://www.selleckchem.cn/products/PLX-4032.html 1.1 TMP直接激活VSMCs上的BK_(Ca)通道开放,钙激活钾电流外流(I_(K(Ca))增加,细胞内K~+流失,K~+浓度([K~+]_i)下降,一方面导致细胞内容量下降,启动VSMCs凋亡;另一方面升高了Caspase
nuclease,启动凋亡,使细胞皱缩,细胞内容量下降。 1.2 TMP可以促进eNOS合成,增加NO,通过直接和/或间接的途径开放BK_(Ca)通道,达到促进VSMCs凋亡的作用。 2 TMP通过非BK_(Ca)通道介导VSMCs凋亡的信号转导通路 2.1 TMP促进eNOS合成,增加NO,NO作用于线粒体,使线粒体细胞膜去极化,诱导释放细胞色素C(cyt-c),cyt-c与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合,激活caspase诱导细胞凋亡。在这条通路上,如果Bcl-2与Apaf-1结合,则Apaf-1不能与cyt-c结合,不能激活caspase,不能诱导细胞凋亡。Bax与Bcl-2结合后,Bcl-2就不能与Apaf-1结合,不会影响Apaf-1激活caspas诱导细胞凋亡。 2.2 TMP促进eNOS合成,NO增加,NO诱导死亡受体(Fas),Fas的激活导致神经鞘脂酶的激活,分解神经鞘脂成为酰基神经鞘氨醇;后者激活caspase从而导致胞内蛋白褪变,细胞凋亡。
心肌纤维化(myocardial PF-02341066体外 fibrosis,MF)是指在正常心肌组织中胶原纤维过量积聚,胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。主要表现为心肌细胞肥大、心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFb)增殖并分泌大量胶原蛋白。研究表明,心肌纤维化是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变,是心室重构的主要表现之一,是心血管系统疾病的独立危险因素。可导致心肌僵硬度增加、心室舒张功能减退、心肌电生理紊乱、心律失常、冠状动脉储备下降甚至引起猝死。所以研究逆转或防治心肌纤维化的药物具有重要的理论价值。
作为第三代血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI),依那普利(enalapril,Ena)在抗高血压、逆转心室肥厚、心室重构等心血管疾病中发挥重要作用。近年来发现其抗心肌纤维化作用明显,但作用机制尤其是分子生物学及信号转导方面机制尚为完全清楚。因此本课题以心肌成纤维细胞为靶点细胞,从体内外两方面观察Ena抗心肌纤维化作用及作用的分子生物学和信号转导机制,旨在阐明心肌纤维化发生机制和药物干预主要靶点。研究内容如下:1.异丙肾上腺素(Iso)诱导心肌纤维化模型,观察Ena对心肌纤维化影响;检测心肌组织中羟脯氨酸含量和超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;通过HE染色、Masson特染、透射电镜、免疫组织化学染色、Western blot等方法观察Ena对心肌形态学和磷酸化丝裂酶原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)、转化生长因子-β_1(TGF-β_1)表达的影响。结果表明:Ena能明显抑制Iso诱导的心肌肥厚;减少胶原纤维含量;降低羟脯氨酸含量;提高SOD含量,降低MDA水平;减少心肌组织中p38MAPK和TGF-β1的表达。2.体外培养CFb细胞,血管紧张素II(AngII)诱导增殖。采用MTT、流式细胞仪观察Ena对细胞增殖和细胞周期的影响;免疫细胞化学染色、流式细胞仪、Western blot分析Ena对细胞周期蛋白cyclinD1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)p27~(kip1)蛋白表达的影响。结果表明:Ena能够明显抑制CFb增殖,使细胞周期阻滞于G_0/G_1期;降低与细胞增殖密切相关的cyclinD1的表达,增加p27~(kip1)蛋白的表达,呈剂量依赖性。3.