荧光显微镜、流式细胞仪观察Ena对活性氧的影响;免疫细胞染色观察Ena对磷酸化p38MAPK核转位的影响;W estern blo

荧光显微镜、流式细胞仪观察Ena对活性氧的影响;免疫细胞染色观察Ena对磷酸化p38MAPK核转位的影响;W estern blot观察Ena对磷酸化p38MAPK表达的影响;免疫细胞荧光染色法和Western blot检测Ena对TGF-β_1表达的影响。结果表明:Ena通过降低活性氧水平抑制p38MAPK核转位,降低TGF-β_1表达从而起到抗心肌纤维化作用。
中草药可抗炎被人们所深信,为数众多的中草药常被宣称具有抗炎的功效,然而大多数缺乏科学性的佐证。因此,若能构建一套可筛选中草药或其提取化合物抗炎的评估方法,尤其使用以分子及细胞学为基础的被国际上认可的方法,在开发中草药的抗炎功效是一项非常重要的发展策略。核转录因子(nuclear factor,NF)-κB是调控基因转录的重要因子,活化的NF-κB可控制许多基因的表达,包括参与炎症反应的多种细胞因子、化学趋化因子以及许多免疫系统的受体,NF-κB可谓是免疫系统的中心枢纽。NF-κB的适度活化对于机体抵御病原微生物的危害具有重要意义,但NF-κB过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放则是引起SIRS、急性呼吸窘迫综合征以及MODs发生的重要机制。因此,构建快速与特异的NF-κB活性检测方法,发现以NF-κB为靶点的化合物,将为炎症和肿瘤防治开辟一条新的途径。在本研究中,我们将pNF-κB-分泌型胎盘碱性磷酸酶(secreted

p38 MAPK activity alkaline phosphatase,SEAP)-新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,NPT)质粒成功地转入小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞,该转染细胞含有NF-κB基序的增强子、SEAP报告基因和新霉素(neomycin)抗性筛选基因,通过检测SEAP报告基因表达水平可反映NF-κB的活化状态。另外,我们在实验体系中引入已知的NF-κB激活剂脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),结果证明LPS可以时间和剂量依赖性地促进pNF-κB-SEAP-NPT转染的RAW

通常 264.7细胞的SEAP报告基因的表达。由于LPS使NF-κB活化至一定水平,提高了实验体系中SEAP基础水平,有利于发现待测化合物的NF-κB抑制作用。该筛选体系具有稳定、特异、高通量等特点,利用该体系,我们对61种中药单体进行了活性筛选,并从中发现了一些对LPS诱导的NF-κB的活化具有较强抑制作用的化合物。一氧化氮(nitric oxide,NO)为炎症反应的标志之一,为了进一步对待测化合物进行抗炎活性筛选,本文利用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞为模型,测定了各待测化合物对LPS诱导的NO产生的影响,结合NF-κB活性抑制筛选结果,我们从诸多化合物中选择了三个既对NF-κB活性具有抑制作用,又能减少NO生成的化合物进一步考察其抗炎活性及作用机制。 其中,从厚朴中提取的新木脂素4-methoxyhonokiol及首次从枳实中提取的三萜类化合物21(α,β)-methylmelianodiol均对LPS诱导的NF-κB活化及NO的生成具有显著的抑制作用。因此,本文应用现代药理学研究手段,首先考察了4-methoxyhonokiol和21α-methylmelianodiol(21α-MMD)对多种急性炎症动物模型的影响,进而应用细胞培养技术、荧光分光光度法、紫外分光光度法、免疫印迹和多聚酶链式反应等方法,在分子、细胞及整体动物水平系统地研究了4-methoxyhonokiol和21α-MMD的抗炎作用及其机理。毛细血管通透性增加是急性炎症反应的一个重要特征,醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加实验则是研究炎症初期反应的一个典型的体内炎症模型,另外,角叉菜胶致足肿胀模型也是一个公认的评价药物抗炎作用的经典方法。因此,我们首先利用这两个模型考察了4-methoxyhonokiol和21α-MMD的体内抗炎活性。实验结果表明:4-methoxyhonokiol(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)和21α-MMD(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)均对醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性的增加以及角叉菜胶致小鼠足肿胀具有显著的抑制作用。在LPS诱导的全身性急性炎症模型中,4-methoxyhonokiol(20mg/kg和100mg/kg,i.p.)和21α-MMD(5mg/kg和20mg/kg,i.p.)均可降低LPS诱导的小鼠血浆NO的生成。结果提示4-methoxyhonokiol和21α-MMD均具有体内抗炎活性。

并且 体内NO和PGE_2的产生有赖于细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)及环氧化酶(cyclooxygenase,COX)-2的表达或酶活性,过量NO和PGE_2的产生与慢性炎症和癌症过程密切相关,因此,通过抑制iNOS和COX-2的表达或活性,有效控制活化的巨噬细胞产生过多的NO和PGE_2可降低炎症疾病和癌症的发生。在LPS诱导的小鼠RAW 264.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

*

You may use these HTML tags and attributes: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>