细胞凋亡是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式,是一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞过程中起着必要的作用。研究显示,高血压是加强脑部氧化应激的一个重要的因素,且高血压和氧化应激之间的循环促进相互作用,高氧化应激状态活化前凋亡机制。长期高血压造成的血管重塑过程中,细胞凋亡是其中重要的组成部分。在压力负荷过重或心衰的动物模型中,局部肾素血管紧张素系统活化是心肌细胞凋亡的关键因素。体外实验和体内实验证明,AngⅡ在肾脏细胞凋亡中起重要作用,阻断AngⅡ可以减弱细胞凋亡。大鼠在高血压的应激状态下会活化前凋亡机制,最终导致神经元丢失。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。Bcl-2家族参与了细胞凋亡的调控,Bcl-2蛋白和Bax蛋白均属于Bcl-2家族,Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白,二者蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关。 综上所述,鉴于中枢神经系统在高血压发生、发展和血压调控中的重要地位和作用,研究慢性肾功能衰竭状态下中枢神经系统,尤其是脑部RAS系统是否活化,及其控制血压可能的机制,将进一步加深对慢性肾功能衰竭及其他慢性肾脏病高血压的发生机制的认识。
或者 本研究首先证实了肾性高血压大鼠脑部PVN部位存在RAS系统的活化,然后进一步证实肾性高血压状态下局部升高的AT1R可以引起细胞凋亡,并且是通过Ras/ERK1/2/caspase-3信号途径介导,并验证这条通路是否参与了交感神经的活化。为了这个目标,我们检测了肾性高血压大鼠和假手术大鼠PVN部位的Ras,p38,ERK1/2,Bax和Bcl-2和caspase-3蛋白的表达。然后我们对肾性高血压大鼠进行侧脑室注射AT1R抑制剂,Ras抑制剂,ERK1/2抑制剂,p38抑制剂和caspase-3抑制剂,观察大鼠血压、交感活性的变化。 Fulvestrant购买 研究方法 第二章肾性高血压大鼠脑核团PVN部位RAS和MAPK及凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达的研究 1：二步法5/6肾切除(5/6Nx)建立肾性高血压模型 1)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位定于鼠台上。
2)酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。 3)依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上下极创面止血,放松血管钳,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。术后肌肉注射青霉素注射液,预防感染。假手术组只做肾包膜剥离术。 4)一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm纵行切口(切口略高于左侧),分离肌层,游离肾脏,无损伤血管钳夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只做肾包膜剥离术。 2.血压和尿样采集 采用股动脉插管法测量大鼠麻醉状态下股动脉血压,处死前最后三天,代谢笼内单只单笼饲养,连续三天收集24h尿液,用于24h尿蛋白定量。
3.大鼠脑标本摘取和采血 3.1大鼠采血及心脏灌注 以3%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血后迅速打开胸腔,16#灌胃针从左心室穿刺入主动脉,同时剪开右心耳,4℃预冷的生理盐水(含肝素20U/ml)200ml快速灌注。 3.2组织样本采集 3.2.1新鲜样本 200ml预冷生理盐水灌注完毕后立即分离大脑,在脑模型中将脑切成薄片,在显微镜下辨认PVN,取出后装入0.5ml的EP管,并保存于-80℃冰箱直至蛋白提取和总RNA提取。 3.2.2用于石蜡切片的样本 200ml预冷生理盐水灌注后继续以4%多聚甲醛400ml灌注,灌完后取下脑,在脑模型中依据大鼠脑图谱包括且避开研究核团位置初步切成2mm的厚块,后固定6h时后梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,核团部位切成5μm薄片用于后续免疫组化实验。 3.3血肌酐检测 采用临床自动生化分析仪检测。 3.424h尿蛋白定量 采用考马斯亮蓝.G250法检测 4.Western blotting检测PVN内RAS成分AT1受体、p-ERK1/2及凋亡蛋白caspase-3等蛋白的表达 将储存于-80℃内的组织取出,称重,按组织重量：裂解液=1：4的比例加入裂解液,用5m1注射器反复吹打组织,以上操作均在冰上进行,完全裂解后,13000g,4℃,离心15min,提取上层匀浆液,即为PVN组织的总蛋白,加入SDS(5×)上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,Western 点击此处 blotting检测ATl受体与p-ERK1/2及凋亡蛋白caspase-3等蛋白的表达。Ras活性蛋白需要先用’Ras Pull-Down and Detection”提纯试剂盒提纯Ras-GTP,再用Western blotting检测。 5.免疫组织化学法检测PVN内RAS成分血管紧张素原(AGT)、ATl受体与AngⅡ的蛋白、p-ERK1/2与Bax的表达 取每只大鼠PVN石蜡切片各3张,经脱蜡、梯度乙醇水化后进行免疫组织化学染色后显微镜下拍照,Image·Pro Plus软件分析,计数阳性细胞的数量。 6.PVN内RAS成分AT1受体、Bax及Bcl-2的mRNA表达的检测 取各组大鼠PVN组织放于1.5ml EP管,按组织重量：Trizol=1:10的比例进行反复吹打,提取组织总RNA,逆转录,Real time PCR检测AT1受体、Bax及Bcl-2的mRNA的表达水平。 7.