从细胞水平验证p-PRAS40-Thr246是否是PI3K-AKT通路导致trastuzumab耐药的关键因子；3.通过建立乳腺癌trastuzumab耐药的裸鼠动物模型,验证拮抗p-PRAS40-Thr246能否逆转乳腺癌的trastuzumab耐药。期望通过以上研究进一步阐明HER2阳性乳腺癌trastuzumab耐药的新机制,为trastuzumab和MK-2206联合治疗HER-2阳性乳腺癌方案的临床应用提供研究依据。第一部分PRAS40-Thr246磷酸化与HER2阳性乳腺癌组织trastuzumab耐药的相关性的临床研究目的通过对临床乳腺癌组织标本的检测及病例资料的分析,探讨乳腺癌组织p-PRAS40-Thr246的表达水平与其临床病理资料、PI3K-AKT信号通路激活状态之间的相关性。并分析P-PRAS40-THR24是否能成为预测乳腺癌trastuzumab治疗效果的分子标记物。材料和方法：收集了55例HER2阳性的原发性乳腺癌的癌组织标本,这些患者术后均应用trastuzumab治疗。所有标本都是术中取材,并且通过福尔马林固定、石蜡包埋的保存。所有的肿瘤临床病理资料、治疗情况和后续的疾病进展情况都是从患者的病历及随访资料中获得的。本实验应用免疫组织化学的方法检测。p-PRAS40-Thr246和PTEN在乳腺癌组织中的表达情况；应用等位基因特异PCR检测PIK3CA基因的突变情况。P-PRAS40-Thr246表达与其他临床病理资料的相关性分析是用卡方检验来分析,用Kaplan-Meier方法分析TTP数据,实验组之间的差异是用log-rank检验来分析,p-PRAS40-Thr246的表达对乳腺癌trastuzumab治疗效果的影响用COX比例风险模型来分析。结果1.乳腺癌组织p-PRAS40-Thr246的表达水平与其临床病理资料之间没有显著相关性。在本研究中,IHC被用于检测p-PRAS40-Thr246在HER2阳性乳腺癌组织中的表达,用于IHC的p-PRAS40-Thr246抗体的特异性及适用性已经被以往的研究所证实。结果如图1所示,p-PRAS40-Thr246在乳腺癌细胞的胞浆中不同强度地广泛表达,并且偶尔在核内表达。根据以往的研究,p-PRAS40-Thr246阳性表达的标准是H评分≥100。运用此标准,共有22例(40%)HER2阳性的乳腺癌被定义为p-PRAS40-Thr246阳性。这些患者p-PRAS40-Thr246的表达水平与其年龄、组织学分级、雌孕激素受体情况等临床病理资料之间没有显著相关性(见表1)。2.乳腺癌组织p-PRAS40-Thr246的表达水平与PI3K-AKT信号通路激活状态之间有显著相关性。本实验对入组的HER2阳性乳腺癌的PI3K-AKT通路的激活状态进行了检测。结果显示,PTEN的缺失在HER2阳性乳腺癌组织中占34.5%(19/55),PIK3CA基因的突变占18.2%(10/55)。另外,在本实验发现的PIK3CA基因突变中,包括7例外显子20的突变(H1047R)及3例外显子9的突变(E542K
并且 and E545K),这些都与文献记载的突变情况相一致。根据文献建立的标准,患者被分为P13K-AKT激活状态(PIK3CA突变或PTEN低表达；n=27)和P13K-AKT未激活状态(PIK3CA基因突变类型和PTEN高表达；n=28)。本实验结果显示,p-PRAS40-Thr246的表达与PI3K-AKT信号通路激活状态、单独的PTEN缺失之间有显著相关性,但与单独的PIK3CA突变之间无显著相关性。这些提示了p-PRAS40-Thr246的表达与PI3K-AKT信号通路激活状态之间,有显著的相关性(见表2)。3. MLN2238溶解度 P-PRAS40-Thr246可能是一种新型的预测乳腺癌trastuzumab治疗效果的分子标记物。应用Kaplan-Meier方法绘制HER2阳性乳腺癌患者的生存曲线(见图2),在经过trastuzumab治疗后,p-PRAS40-Thr246阳性的患者比那些p-PRAS40-Thr246阴性的患者有着更短的TTP。单变量回归分析被用于确定疾病进展与HER2阳性乳腺癌trastuzumab治疗前PI3K-AKT通路激活状态的关系,PIK3CA基因突变和／或PTEN缺失的患者与其他患者相比,在疾病进展方面有更高的风险。单变量回归分析还显示,患者组织学分级情况也对患者的总体生存时间有影响。以上各影响因素均同时进入多因素回归分析,结果显示,p-PRAS40-Thr246阳性是HER2阳性乳腺癌疾病进展的一个有意义的独立预后因子(表2,HR 2.081；95%的可信区间,1.113-3.890；P=0.022),它能够预测乳腺癌trastuzumab治疗的效果。结论通过临床标本检测及相关病理临床数据的分析,提示P-PRAS40-Thr246在乳腺癌组织中表达,其表达水平与PI3K-AKT信号通路激活状态之间有显著相关性。乳腺癌trastuzumab耐药的发生与p-PRAS40-Thr246有关,P-PRAS40-Thr246是PI3K-AKT通路中导致trastuzumab耐药的关键因子。临床检测p-PRAS40-Thr246可以预测乳腺癌trastuzumab治疗的效果。第二部分PRAS40-Thr246磷酸化在HER2阳性乳腺癌细胞trastuzumab耐药中的作用机制的细胞学研究目的本实验以乳腺癌SKBR3和SKBR3/TDR细胞为研究对象,在细胞水平探讨MK-2206对其杀伤及逆转trastuzumab耐药的作用,验证拮抗p-PRAS40-Thr246的表达能否部分逆转HER2阳性乳腺癌细胞的trastuzumab耐药,为乳腺癌的临床用药提供依据。材料和方法通过诱导的方法建立对trastuzumab耐药的HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3/TDR,以不同浓度的MK-2206处理人乳腺癌SKBR3细胞和SKBR3/TDR细胞,观察MK-2206对SKBR3和SKBR3/TDR细胞的抑制增殖作用。采用CCK-8法检测细胞的耐药倍数和耐药逆转率,观察MK-2206与trastuzumab合用对于SKBR3/TDR细胞的耐药逆转情况,采用FCM法检测细胞凋亡以及trastuzumab的蓄积情况。采用Western
Erlotinib研究购买 blot法检测]p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。观察MK-2206处理SKBR3和SKBR3/TDR细胞后,对p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达的影响。结果1.CCK-8检测结果提示,不同浓度的trastuzumab和MK-2206均对SKBR3和SKBR3/TDR细胞有抑制增殖的作用,且呈剂量依赖性(图4、图5)。其中trastuzumab对SKBR3和SKBR3/TDR的IC5o分别为(57.32±1.64) ug/ml及(248.24±1.92) ug/ml,耐药倍数为4.33倍。MK-2206对SKBR3和SKBR3/TDR的IC50分别为(40.74±1.66) nmol/L及(43.66±1.