临床病例分析:观察原发性肝细胞肝癌患者中吸烟以及PDCD4表达情况的关系。由于影响肝细胞肝癌发病的因素很复杂,为了去除比较极端的因素,本研究制定了入选标准:1)男性;2)年龄＞30岁;3)HBsAg阳性;4)术前通过影像学检查除外肺转移及其他肝外转移;5)经历肝细胞肝癌手术切除治疗,术中确定剩余肝脏无肿瘤残余;6)术后病理证实为肝细胞肝癌,且标本切缘无肿瘤残余。严格准入条件以尽量减少可能的干扰因素。收集患者手术切除的肿瘤组织标本及癌旁无肿瘤细胞的正常组织标本,应用免疫组织化学法和western

blotting法检测肿瘤组织中及癌旁正常组织中PDCD4的表达情况。通过问诊确定患者吸烟情况,明确患者每天吸烟平均支数,以及吸烟总年数,换算成每年吸烟的包数(按照每包20支烟计算),同时综合考虑患者病情确诊时的年龄,手术中发现的肿瘤的大小,数目,门静脉及肝静脉侵袭情况,肝内胆管侵袭情况,肝脏总体情况,以及肿瘤组织的分化情况。组织在数据搜集后被编码,然后通过SPSS11.5统计学软件对结果进行曼-惠特尼U检验和菲希尔精确度检验,并以P＜0.05确认存在显著性差异。 2.培养正常人类肝细胞L02,肝癌细胞HepG2,应用针对人PDCD4的特异性抗体,通过western blot法及免疫细胞化学法检测在这二种细胞中PDCD4的表达情况的区别。根据以往研究提供的方法制备香烟提取物,简单来说,就是将两支不带过滤装置的香烟连接一个改良过的注射器,使燃烧产生的烟雾通过50ml不含血清的DMEM培养液,通过测定pH值来确定终止点,在pH值达到7.4的时候终止。然后通过孔径0.20μm滤膜除去细菌和杂质。应用5%浓度的CSE作用于人肝细胞L02不同时间,四氮唑蓝法(MTT)检测细胞活性增殖性改变情况,RT-PCR检测PDCD4基因改变情况。然后分别应用不同浓度(1%,5%,10%)的CSE作用于L02细胞4个小时,并应用5%CSE分别刺激L02细胞不同时间(1h,4h,16h,24h),通过western

因为 blot法检测观察PDCD4蛋白水平改变情况。通过使用新蛋白翻译抑制剂放线菌酮,结合应用5%CSE刺激L02细胞4小时,观察CSE对PDCD4蛋白的作用是发生在翻译阶段还是翻译后阶段。分别应用相关通路特异性阻断剂:PKC阻断剂Ro31-8425,MEK-ERK阻断剂PD98059,PI3K阻断剂LY294002,p38MAPK阻断剂SB203580,JNK阻断剂SP600125预处理细胞,然后应用5%CSE刺激L02细胞4小时,收集细胞提取蛋白通过western blot测定PDCD4蛋白含量改变情况,以观察上述通路在CSE对PDCD4作用过程中起的作用。 结果: 1.临床病例分析结果发现,在分析的68名男性并且不伴转移的原发性肝细胞肝癌患者中,吸烟组和不吸烟组的肿瘤组织中PDCD4表达无明显差异(P＞0.05)。但是在癌旁正常组织的比较中,吸烟组PDCD4的表达明显低于不吸烟组(P＜0.05).分别对吸烟组和不吸烟组的肿瘤组织和癌旁组织中PDCD4含量进行比较,发现在这两组中,肿瘤组织中PDCD4的含量较之癌旁正常组织中的均有所降低,不吸烟组的肿瘤组织和癌旁组织中PDCD4的差别更加显著(P＜0.01).对于其他相关因素比较,我们发现吸烟组的平均发病年龄比不吸烟组低,而不吸烟组患者的肝脏一般情况较差,二组在肝内门静脉,肝静脉及肝内胆管的侵及程度上没有显著性差异。

点击此处 已经 2.通过对正常肝细胞L02及肝癌细胞HepG2中PDCD4含量的比较,我们发现肝癌细胞中PDCD4蛋白含量较正常肝细胞减少,这一区别具有显著性差异(P＜0.05)。应用5%浓度的CSE作用于人肝细胞L02不同时间,MTT检测结果发现对细胞活性并无明显影响,RT-PCR结果显示PDCD4的mRNA的表达在CSE刺激下并无明显改变。通过不同浓度CSE的刺激和同一浓度不同时间的刺激,我们发现CSE刺激可以减少PDCD4蛋白水平,并且这一作用呈现一定的剂量和时间依赖性。通过结合应用新蛋白翻译抑制剂放线菌酮和5%浓度的CSE,我们发现同时应用这两者的情况下PDCD4蛋白水平随时间变化减少的更加迅速(P＜0.05),这说明CSE对PDCD4的作用可能是发生在翻译后。通过应用特异性通路阻断剂:PKC阻断剂Ro31-8425,MEK-ERK阻断剂PD98059,PI3K阻断剂LY294002,p38 MAPK阻断剂SB203580,JNK阻断剂SP600125预处理细胞,然后应用5%CSE刺激L02细胞4小时,通过western blot检测PDCD4表达情况,我们发现Ro31-8425,PD98059,LY294002均可明显改变CSE减少PDCD4含量的作用,而SB203580,SP600125没有明显作用。 结论: 1.原发性肝细胞肝癌中存在PDCD4含量减少的情况。吸烟与不吸烟者肿瘤组织中PDCD4含量没有明显差异,提示PDCD4作为肿瘤抑制物减少到一个临界点后发生了肝癌,之后可能由于某种反馈调节机制不再继续减少;吸烟者癌旁组织中PDCD4减少更加明显,提示吸烟肝癌患者预后较之不吸烟者可能更差。 2.