MTT法检测Weel抑制剂MK-1 775和化疗药物阿霉素对细胞活性的影响：将ALL细胞Nalm-6、Jurkat、Sup-T1、Molt-4和正常骨髓基质细胞HS-5接种于96孔培养板中,加入不同浓度的MK-1775、阿霉素或者两者联合培养24、48、72小时,MTT法检测MK-1775对ALL细胞和HS-5活性的影响,计算细胞活性和半数抑制浓度(IC50)。3.流式细胞术检测Weel激酶抑制剂MK-1775对ALL细胞周期的影响：将Nalm-6和Jurkat细胞接种于6孔培养板中,加入OnM、100nM、300nM的MK-1775,继续培养24小时,PI染色,流式细胞术检测细胞DNA含量,ModFit
LT软件计算细胞周期的变化。4. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡：ALL细胞系接种于6孔培养板中,加入不同浓度的MK-1775、阿霉素或者两者联合作用,培养24或48小时,收集细胞,Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞术检测FITC/PI阳性细胞,Summit 5.2软件计算凋亡率。5. Western blot检测相关蛋白的表达：ALL细胞系接种于培养瓶中,分别加入一定浓度的MK-1775、阿霉素或者两者联合作用,继续培养24小时,收集细胞,提取蛋白质,用10%SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,Western 哪里 blot检测CDK1、p-CDK1、p-H3、PARP1、γH2AX、AKT、mTOR、p-mTOR、bcl-2、Notch1、 Hes1蛋白的表达。研究结果：1. Weel基因在ALL组和对照组的表达：Weel mRNA在ALL组的表达相对量=2-△Ct(ALL)=0.15±0.08,Well mRNA在对照组的表达相对量=2-△Ct(对照组)=0.09±0.05,ALL组表达高于对照组(p0.05)和33.3+5.4%(与对照比p>0.05),S期比例分别为55.1±7.7%、60.2±9.6%(与对照比p>0.05)、61.4±17.2%(与对照比p>0.05),G2/M期比例分别为3.3±2.0%、3.9±3.5%(与对照比p>0.05)、7.2±9.0%(与对照比p>0.05),与对照比,G1期、S期和G2/M期比值改变统计学无差异；Jurkat细胞G1期比例分别为42.54±4.1%、43.3±7.5%(与对照比p>0.05)、15.64±3.5%(与对照比p0.05)、62.64±9.6%(与对照比p0.05)和27.0±4.9%(与对照比p<0.05)、88.83±7.65%(与对照比p<0.05)：Jurkat细胞凋亡率分别为2.12±0.47%、41.26±12.30%(与对照比p<0.05)、70.08±8.52%(与对照比p
第一部分中国人非小细胞肺癌PIK3CA基因突变研究肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤相关死亡率中居首位。其中,约85%是非小细胞肺癌,主要包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等。近来年,尽管外科手术治疗、肿瘤含铂化疗和以吉非替尼、厄罗替尼为代表的靶向治疗等取得了长足的发展,但全球范围内非小细胞肺癌的5年生存率仍只有10%-15%。研究表明,磷脂酰肌醇3激酶(P13K)通路与肿瘤生成密切相关。靶向于P-13K通路成员的抑制剂被证明有明显抗肿瘤作用并已进入临床试验。然而,对PIK3CA基因突变、扩增以及PI3K
Brefeldin A核磁共振 查找更多 P110 α, p-Akt, mTOR, PTEN表达的综合分析罕有报道。中国人非小细胞肺癌PIK3CA基因突变及与其他驱动癌基因突变关系仍不很清楚。弄清以上问题,将有利于了解中国人群PIK3CA基因突变现状并有助P13K靶向药物患者选择。基于以上情况,我们开展本部分研究,回顾分析复旦大学附属肿瘤医院1117例临床肺癌手术切除新鲜冰冻标本,提取RNA,逆转录为cDNA后进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。对PCR产物进行基因测序检测PIK3CA(9号外显子和20号外显子),EGFR(18-21号外显子),KRAs(2号和3号外显子),HER2(18-21号外显子),BRAF(11-15号外显子),AKT1(2-3号外显子)的基因突变以及ALK(EMLL4-ALK，KIF5B-ALK和TFG-ALK)基因融合情况。对研究中发现的PIK3CA突变标本及野生pIK3CA对照标本(连续收集自2008年7月至2009年6月肺鳞癌、腺癌野生PIK3CA样本),以荧光原位杂交(fluorescent
in situ hybridization, FISH)法检测PIK3CA基因拷贝数,以免疫组织化学法(immunohistochemical,IHC)检测PI3K P110 α, p-Akt, mTOR和PTEN的表达。研究发现,1117例非小细胞肺癌中共有34例PIK3CA基因突变,807例腺癌和310例鳞癌中PIK3CA的突变频率分别为2.7%和3.9%。在34例PIX3CA突变中,17例伴EGFR突变,4例伴KRAS突变。PIK3CA基因突变与PI3K P110α(p=0.0001), p-Akt(p=0.024)以及mTOR(p=0.001)表达呈正相关,但与PIK3CA基因拷贝数无明显相关性(p＝0.463)。仅存在PIK3CA突变患者的总生存时间较pIK3CA-EGFR/KRAs共突变者明显缩短(p=0.