1、Zscan4d、Mu ERV-L和e IF-1A等ZGA标志基因m RNA的表达水平。5.收集KM小鼠1细胞胚,分别置于KSOM和含API-2(2μM)的KSOM培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,运用Real-Time PCR技术检测干细胞因子Oct4和Sox2的m RNA表达水平。结果:1.p-Ser473-Akt和pan-Akt存在于小鼠植入前胚的1-细胞至4-细胞阶段。作为Akt主要的活性形式,p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化,其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相(minor 而且 ZGA和major ZGA)基本一致。pan-Akt主要分布在胞质里,在不同发育阶段的细胞中其表达和定位没有发生明显的改变;2.Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性。一定浓度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使体外培养的1-细胞胚出现“2-细胞阻滞”现象;3.2.0μM API-2和30μM MK2206阻滞的2-细胞胚内,p-Ser473-Akt在细胞核内的表达发生了明显的下调,而pan-Akt的定位与表达并没有产生明显的变化;4.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内,Mu ERV-L和e IF-1A的m RNA水平明显低于KSOM对照组(P0.05)。5.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内,干细胞因子Oct4的m RNA水平明显低于KSOM对照组(P0.05)。结论:Akt主要活性形式p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化,其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相(minor
ZGA和major ZGA)基本一致,提示p-Ser473-Akt可能参与ZGA过程。Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用,一定浓度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使体外培养的1-细胞胚出现“2-细胞阻滞”现象,同时,也使2-细胞胚核内p-Ser473-Akt表达水平下降。且一定浓度的API-2(2.0μM)使2-细胞胚内ZGA标志基因Mu Pifithrinα ERV-L和e IF-1A,以及干细胞因子Oct4的m RNA水平明显下调。这些结果进一步证实,Akt特异性抑制剂诱导产生的“2-细胞阻滞”,以及ZGA启动失败和干细胞因子Oct4表达下调与其降低核内p-Ser473-Akt表达水平有关。
背景与目的：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)作为一种信号鞘磷脂，绝大多数与高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)结合，并介导HDL诸多生物功能如抗动脉粥样硬化、抗血栓和保护血管内皮等。S1P通过其5个受体(S1PR1~S1PR5)激活细胞内复杂的信号转导通路实现生物功能多样化。其中S1PR1/3在细胞增殖、血管发生和重建、神经形成、免疫细胞迁移、炎症反应、内皮细胞屏障功能等方面发挥重要作用，但有关S1PR1/3对巨噬细胞内胆固醇代谢的影响未见报道。因此，本论文主要探讨S1P通过S1PR1/3对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的调控作用及其信号机制，为全面了解S1P的抗动脉粥样硬化机制提供新的理论基础。 方法：1.佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)诱导THP-1单核细胞24h后，选择不同时间和浓度的S1P进行处理，人胆固醇Elisa试剂盒检测细胞培养液中胆固醇含量。2.分别用VPC23019(S1PR1/3抑制剂，10μM)和JTE-013(S1PR2抑制剂，10μM)孵育THP-1源性巨噬细胞12h，然后加BODIPY-Cholesterol孵育过夜，激光共聚焦显微镜下观察胆固醇分布、定位和含量变化，同时用油红O染色显示细胞内脂质蓄积情况。3. VPC23019(10μM)处理THP-1源性巨噬细胞4h后，WesternBlot检测PI3K-Akt信号通路及NF-κB(P65)的蛋白活性，VPC23019(10μM)处理THP-1源性巨噬细胞24h后，Western Blot检测LXR及其下游基因ABCA1和ABCG1蛋白表达水平。4.分别以LY-294002和MK2206阻断P13K-Akt信号通路后，采用Western
Blot检测ABCA1的蛋白表达水平，RT-PCR检测ABCA1和ABCG1的mRNA表达水平，BODIPY-Cholesterol荧光探针结合荧光显微镜，观察THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量，荧光分光光度计检测培养液中胆固醇浓度和胆固醇外流情况。 哪里 结果：1.1μM S1P处理THP-1源性巨噬细胞24h，培养液中胆固醇含量达到最高。 2. THP-1源性巨噬细胞胆固醇大部分选择性定位于细胞胞膜上，S1P可降低THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量。3.与对照组相比，S1PR1/3抑制剂VPC23019下调THP-1源性巨噬细胞PI3K-Akt信号通路活性，并增加NF-κB (P65)蛋白活性，降低LXR、ABCA1和ABCG1的蛋白表达水平。4.分别用S1PR1/3抑制剂、PI3K抑制剂和Akt抑制剂阻断S1PR1/3-PI3K-Akt信号通路后，ABCA1和ABCG1的蛋白及mRNA表达水平下降，THP-1源性巨噬细胞内胆固醇含量增加，胆固醇外流减少。 结论: 1.S1P促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出。 2.S1PR1/3-PI3K-Akt信号转导通路参与S1P对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的调控作用。
随着分子生物学的研究发展，肿瘤的发病机制的认识逐渐深入，从过去的单一因素研究上升到多因素致病理论。研究肿瘤细胞增殖过程和细胞信号通路机理与药物的关系，为抗肿瘤药物研究开辟新的道路。具有潜在抗肿瘤活性的苯并咪唑及三联吡啶衍生物已大量进行研究，本论文以此为配体，合成了两个系列的钌配合物，通过对其进行抗肿瘤活性的筛选及细胞凋亡机制研究，结果表明抗肿瘤活性高且毒副作用较小的硝基苯并三联吡啶钌配合物可作为继续进行研究的潜在抗肿瘤药物。其主要结果如下： 设计并合成了两个系列钌配合物，其中包括八个苯并三联吡啶衍生物钌配合物和六个苯并咪唑吡啶类钌配合物，通过ICP-AES、ESI-MS、1HNMR、IR等方法对所合成的配合物进行表征，其结果与预期一致，表明所合成的配合物为目标产物。 选择多种肿瘤细胞株和正常细胞株，通过检测细胞存活的方法对所合成的配合物进行抗肿瘤活性筛选，结果表明所合成的配合物对所选癌细胞株都明显具有抑制生长作用，对正常细胞毒性较小；配合物的抗肿瘤活性并不完全同配体的共轭π键大小成正比；在配体上引入基团会影响其抗肿瘤活性；硝基的引入极大提高了配合物的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性同顺铂相当的硝基苯并三联吡啶钌配合物抑制A375恶性黑色素瘤细胞的IC50值为16.9μM，硝基苯并咪唑吡啶钌配合物抑制Nerua-2a神经胶质瘤细胞的IC50值为5.