8.将WT1启动子从5′端截短为不同长度(-1522bp、-1022bp、-522bp),并构建荧光素酶报告基因,培养OV、NC细胞,并分别共转染报告基因和TK质粒(内参),转染24小时后收取细胞,检测生物发光的量。9.用Ad-NR4A1-HA及Ad-GFP分别感染MIN6细胞48小时,按照ChIP试剂盒操作步骤进行实验,用HA点击此处抗体沉淀NR4A1,此时跟NR4A1结合的片段也被一起沉淀,设计引物,用PCR扩增WT1启动子中包含NR4A1结合位点的片段。研究结果1.在过表达NR4A1的细胞(OV细胞)中抗氧化分子GPX1、CAT、SOD1、WT1、ERG1在mRNA水平显著高于对照细胞(NC细胞),SOD2mRNA水平无明显变化PD98059临床试验;SOD1、WT1、Bcl-2的蛋白水平在OV细胞中显著高于对照细胞,SOD2、SIRT1蛋白水平无明显变化。通过查看WT1的启动子的序列,发现WT1启动子上有一个NR4A1的结合位点(-1118bpto-1111bp)。2.成功构建表达C-端带有HA标签(tag)的NR4A1腺病毒(Ad-NR4A1-MAPK Inhibitor Library clinical trialHA),感染MIN6细胞能够达到近100%的感染率。用上述腺病毒及对照病腺毒感染培养的MIN6细胞48小时后,Q-PCR结果显示感染Ad-NR4A1-HA的细胞NR4A1、WT1的mRNA表达量显著高于对照病毒感染的细胞;Western blot结果显示,感染Ad-NR4A1-HA的细胞中SOD1、Bcl-2、WT1的蛋白水平显著高于对照病毒感染的细胞,SOD2蛋白水平无明显变化。