抗纤维化药物筛选模型的建立 COL1A1启动子报告基因载体的构建。根据COL1A1基因上游的序列设计合成扩增引物,以人基因组DNA为模板,PCR扩增COL1A1启动子序列,将其插入报告基因载体pGL4中,构建COL1A1启动子报告基因载体pGL4-COL1A1promoter,限制性酶切和DNA测序鉴定其正确性。
抗纤维化药物筛选模型的建立及检测。以LX-2细胞为宿主细胞,将COL1A1启动子报告基因载体与内参报告基因载体共转染LX-2细胞,24h后收集细胞,双报告基因检测COL1A1启动子活性。抗纤维化药物筛选模型建立之后,使用对Ⅰ型胶原蛋白表达有抑制作用的TGFβ1siRNA验证其有效性。结果:TGFβ1siRNA不影响COL1A1启动子活性。分析其原因:一方面可能与细胞内源性TGFβ1表达低下有关;另一方面与正常LX-2细胞COL1A1启动子处于低活化状态有关。拟外源表达活化剂TGFβ1活化LX-2细胞,模拟肝纤维化肝星状细胞的高活化状态,再进行药物评价实验。 2.抗纤维化药物筛选模型的优化 抗纤维化药物筛选模型的首次优化。以HepG2细胞提取的总RNA逆转录产物为模板,PCR扩增TGFβ1全长编码基因,插入到表达载体pcDNA3.1中,构建TGFβ1的重组载体pcDNA3.1-TGFβ1,限制性酶切和DNA测序鉴定为正确连接的克隆。将pcDNA3.1、pcDNA3.1-TGFβ1分别与COL1A1启动子报告基因载体及内参报告基因载体共转染LX-2细胞,24h后收集细胞,双报告基因检测COL1A1启动子活性。结果:过表达TGFβ1仅使COL1A1启动子活性提高了不到2倍(t=3.396,P=0.0274)。推测其原因:可能是TGFβ1在细胞内表达但没有分泌到细胞外,无法与细胞膜受体结合进而发挥作用。拟构建含分泌信号肽的TGFβ1重组表达载体,验证上述推测是否正确。 抗纤维化药物筛选模型的再次优化。同上方法构建含分泌信号肽的TGFβ1重组表达载体pJW4303-TGFβ1。将pJW4303、pJW4303-TGFβ1分别与COL1A1启动子报告基因载体及内参报告基因载体共转染LX-2细胞,24h后收集细胞,双报告基因检测COL1A1启动子活性。结果:分泌表达TGFβ1使COL1A1启动子活性提高了200倍以上(t=21.78,P=0.0001)。该结果验证了上述推测:TGFβ1只有被分泌到细胞外并与自身细胞膜受体结合后才能发挥活化作用。故选择pJW4303-TGFβ1用于抗纤维化药物筛选模型的优化。
selleck化学 KU-60019 3.抗纤维化药物筛选模型的有效性鉴定 文献报道糖皮质激素类药物地塞米松可以下调COL1A1启动子活性进而抑制Ⅰ型胶原蛋白表达,故选其作为阳性模式药物来鉴定该筛选模型的有效性。在高活化状态的筛选模型中,加入不同浓度地塞米松,观察其抑制效果。结果:地塞米松对COL1A1启动子活性具有明显的抑制作用且具有剂量依赖关系。这说明该模型可以用于筛选和评价抑制I型胶原蛋白表达的抗纤维化药物。 本研究证实了HBV能感染LX-2细胞并促进Ⅰ型胶原蛋白表达;HBV编码蛋白尤其是HBx能上调COL1A1启动子活性进而促进Ⅰ型胶原蛋白表达;TGFβ1不参与而P38MAPK通路参与HBx对Ⅰ型胶原蛋白的调控。另外,本研究以COL1A1启动子活性调控机制为基础,建立了一种新型抗纤维化药物筛选模型,为抑制COL1A1启动子活性进而抑制Ⅰ型胶原蛋白表达的抗纤维化药物研究奠定了基础。
目的:通过观察OSAHS合并高血压大鼠血浆中TNF-α、Leptin水平变化,探讨TOLL样受体4(TLR4)是否通过JNK信号通路对脂肪细胞因子进行调控,借此探索OSAHS合并高血压的可能发病机制。方法:将雄性SD大鼠48只随机分为3组,即:正常对照组、缺氧6周组、缺氧8周组,实验时将实验组大鼠放入密闭玻璃舱内,玻璃舱内充入氮气和氧气,每天缺氧8h,每次循环120秒,将正常对照组大鼠置于相同规格的玻璃舱内,充入空气,无缺氧。于实验前、试验后检测各组大鼠血压。于间歇低氧42、56天后先后处死实验6组和实验8周组大鼠,采用荧光定量PCR、Western-Blotting方法观察脂肪组织中TLR4受体和JNK受体的表达情况,ELISA方法观察大鼠血浆中TNF-α、Leptin含量的变化,HE染色方法观测大鼠肾动脉的病理变化。取间歇低氧8周组大鼠脂肪组织进行原代培养脂肪细胞,通过细胞免疫组织化学以及油红O法鉴定前脂肪细胞和成熟脂肪细胞;分为4组脂肪细胞,即:间歇缺氧8周模型组(缺氧8周组),间歇缺氧8周脂多糖诱导组(LPS诱导组),间歇缺氧8周TLR4阻滞组(TLR4阻滞组),间歇缺氧8周JNK阻滞组(JNK阻滞组)。利用荧光定量PCR法和Western-blot法观察脂肪细胞中TLR4受体、JNK受体mRNA和蛋白质的表达,利用ELISA法观察脂肪细胞培养液中TNF-α、Leptin的含量。结果:1模型组大鼠尾动脉压增加,并且出现肾动脉管腔变小、肾动脉管壁变厚的病理变化,因此成功建立了OSAHS合并高血压大鼠模型。2间歇性缺氧6周组、间歇性缺氧8周组血清TNF-α、Leptin含量比正常对照组显著升高(P<0.01,P<0.01),且缺氧8周组更显著(P<0.05)。3缺氧6周组、缺氧8周组脂肪组织中TLR4受体、JNK受体的表达水平与正常对照组相比明显升高(P<0.01,P<0.01)。4培养出OSAHS合并高血压模型原代大鼠脂肪细胞;采用油红O染色方法可见脂肪细胞胞内出现红染色颗粒;采用细胞免疫组化可见细胞胞浆着色成棕黄色。5TLR4介导JNK信号通路在脂肪细胞中的表达:与间歇性缺氧8周组相比,脂多糖诱导剂使TLR4受体、JNK受体mRNA和蛋白的表达增加(P<0.05);TLR4阻滞剂使TLR4受体、JNK受体mRNA和蛋白的表达减少(P<0.05,P<0.05);JNK阻滞剂可以使JNK受体mRNA和蛋白的表达减少(P<0.05),而对TLR4受体mRNA和蛋白的表达无意义。6OSAHS合并高血压模型大鼠脂肪细胞中TLR4介导的JNK信号通路对TNF-α、Leptin分泌的调控:脂多糖诱导剂组比间歇缺氧8周组TNF-α、Leptin分泌增加(P<0.05),TLR4阻滞剂组、JNK阻滞剂组比间歇缺氧8周组TNF-α、Leptin分泌均减少(P<0.05,P<0.05)。结论:TLR4介导的JNK炎症信号通路在OSAHS合并高血压的发生、发展中发挥重要作用,为进一步寻找更有效的治疗方法奠定了基础。
[目的]
还有 采用基因芯片技术检测油酸型急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome ARDS)大鼠肺组织中炎症免疫相关基因的表达;应用AG490(氰-3,4-二羟基-N-苄基肉桂酰胺)和GCs(糖皮质激素)干预ARDS大鼠,观察其RhoA基因表达变化;通过建立体外脂多糖(LPS)诱导RAW264.