7巨噬细胞上使用毒胡萝卜素(Thapsigargin ,Tg)复制内质网应激模型,在此基础上不给予或给予fucoidan处理后,通过Western blot检测LC3(microtubule associated protein light chain 3)的表达从而反映自噬发生水平的变化。同时给予稳定表达GFP-LC3(Green fluorescent protein-LC3)的RAW264.7细胞不同处理后,通过激光共聚焦显微镜直接观察自噬体形成的变化。在明确fucoidan对内质网应激所诱导的自噬是否产生影响后,探讨fucoidan通过激活何种信号途径调控自噬的发生水平。信号通路的检测主要依赖于Western
blot技术。本课题重点观察了fucoidan是否对AKT/mTOR/p70S6K信号通路产生影响,接着使用mTOR特异性阻断剂Rapamycin抑制AKT/mTOR/p70S6K信号通路,并用AnnexinV/PI双染流式细胞仪和Western blot方法测定细胞的凋亡情况。最后利用SR-A基因敲除型和野生型小鼠腹腔巨噬细胞,研究了SR-A与AKT/mTOR/p70S6K信号通路改变之间的可能联系。 结果: 用Tg和Tg+Fucoidan分别处理RAW264.7细胞8-12小时后,发现Tg+fucoidan处理组LC3-Ⅱ表达较Tg处理组明显减弱,表明fucoidan和Tg共处理后明显抑制了Tg诱导的巨噬细胞自噬的形成。这种抑制效应在处理后12小时最为明显。同时,给予稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞不同处理后,用激光共聚焦显微镜观察自噬体形成的变化,结果与western 而且 blot检测的LC3-II表达水平相一致,Tg+fucoidan共处理组后抑制了内质网应激诱导的自噬体的形成。 为了阐明fucoidan通过何种通路抑制内质网诱导的自噬的形成,我们又对调控自噬的最关键信号通路mTOR信号通路进行了研究。结果显示Tg+fucoidan处理细胞4小时后,可明显激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,提示fucoidan可能通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制内质网应激诱导的自噬形成。
我们接着应用mTOR通路特异性抑制剂Rapamycin干扰AKT/mTOR/p70S6K信号通路,来观察细胞自噬水平的变化。当用Rapamycin预处理RAW264.7细胞30min后再给予Tg+fucoidan处理,发现p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K磷酸化活性均被明显抑制,LC3-Ⅱ的表达明显上调。这些实验结果表明,阻断mTOR通路后,fucoidan抑制内质网应激所诱导的自噬的形成得到了解除,从而进一步证明了fucoidan通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制了内质网应激诱导的自噬形成。 随后,我们观察了给予Rapamycin干扰AKT/mTOR/p70S6K信号通路后对于Tg + fucoidan共处理组细胞凋亡率的影响。实验结果显示,Tg + fucoidan+Rap处理组与Tg + fucoidan处理组相比,细胞凋亡率明显降低。这就说明了fucoidan可能是通过激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路,抑制了内质网应激诱导的自噬的形成,从而促进了巨噬细胞的大量凋亡。 由于fucoidan是SR-A的配体,因此我们想进一步知道fucoidan激活AKT/mTOR/p70S6K信号通路是否通过SR-A所介导。于是SR-A基因敲除小鼠模型被用作试验。实验结果显示,Tg 有 + fucoidan处理野生型(SR-A+/+)小鼠腹腔巨噬细胞后,与TG组相比,p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K被明显激活。而在SR-A敲除(SRA-/-)小鼠腹腔巨噬细胞中,上述蛋白的表达差异均不明显。因此,fucoidan可能是通过与SRA结合后,激活了AKT/mTOR/p70S6K信号通路。 结论: 作为A类清道夫受体的配体,fucoidan与SR-A结合后,可能通过激活AKT-mTOR-p70S6K通路,抑制了由ER stress所诱导的巨噬细胞自噬的发生,从而促进了巨噬细胞的大量凋亡。
目的神经管畸形(neural tube defects;NTD),是最常见的出生缺陷之一。主要表现为无脑儿、脑膨出和脊柱裂等。神经管的发育和分化是一个非常复杂的生物进化过程,并且受各种致畸因素调节和影响,其中最重要的就是环境致畸中的高温因素。在人类,最大的高危因素被认为是孕妇高温。大量的动物实验和对人类的流行病调查证实,孕妇早期接受到物理性的有害因子,如过热的热水浴和高温作业等,都可使孕妇体内产热增加或散热不良而致高热。早期的胚胎极易受到高温环境的损害,高温会阻碍那些分裂中的细胞,使该组织停止发育,特别是胎儿的中枢神经系统极易受到损伤,造成神经管畸形,严重者使胚胎夭折。高温可引起胚胎发育基因的低表达、不表达或超表达,使某些与细胞分化相关的蛋白,特别是酶蛋白和信息传递蛋白异常,从而使细胞分化异常,最终引起神经管发育中信号传导机制障碍,很可能通过改变信号通路上蛋白激酶的表达和功能使胚胎正常的细胞凋亡发生紊乱,从而引起神经管畸形。近年来研究发现,高温刺激能促使丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated
可能 protein kinases,MAPK)家族中的ERK1/2和JNK1/2发生磷酸化和凋亡基因Caspase-3的活化,证实了细胞凋亡在高温致胚胎先天性神经管畸形中的作用。而JNK/SAPK及p38MAPK为MAPK家族应激激活的蛋白激酶,这2条通路的激活参与多种应激所介导的细胞凋亡,说明p38MAPK有可能也参与高温致神经管畸形的发生。本研究在高温致NTD动物模型上,采用RT-PCR和Western blotting方法检测正常发育中的神经管和高温致畸胚的神经管中p38MAPK以及Bax/Bcl-2, Caspase-3的表达情况,以观察p38MAPK以及Bax/Bcl-2, Caspase-3在神经管正常发育中的作用及其与高温致神经管之间的关系。 方法采用本实验室建立的高温致金黄地鼠畸形的动物模型,将60只孕鼠按完全随机设计分组法分为实验组和对照组。实验组30只,对照组30只,实验组于受精第8天下午3时,置42℃水浴,持续20min,然后将其分为5个时相点,每个时相点6只,分别于处理后8、16、24、48、72h剖腹取胎,在解剖镜下分离新鲜胚胎组织。对照组30只于同样时间进行水浴处理,水温为37℃,持续20min。对照组在相应时间取材。采用RT-PCR和Western blotting方法检测正常发育中的神经管和高温致畸胚的神经管中p38MAPK的表达情况,以及采用Western blotting方法检测正常发育中的神经管和高温致畸胚的神经管中Bax/Bcl-2, Caspase-3的表达情况。 结果1.