00 vs 2.07、0.91 vs 0.84和2.30 vs 0.65;另外,MDC染色结果显示,8Gy IR使三组细胞中MDC阳性细胞率分别增加了136%,27%和-55%。表明沉默ATM抑制H1299细胞中IR诱导的自噬水平,虽然沉默MAPK14增加H1299的基础自噬水平,但是8Gy

IR诱导后其自噬水平下降。提示沉默ATM和沉默MAPK14均可抑制H1299细胞中IR诱导的自噬水平。7.抑制ATM和MAPK14减弱IR对m TOR信号通路的抑制作用与假照组相比,8Gy IR处理Hela细胞后,AKT,P-m TOR和P-P70S6K表达水平分别下降46%,59%和58%,经100n M selleck激酶抑制剂 KU55933预处理后,各基因表达水平分别下降36%,28%和21%。Hela沉默细胞模型中,与假照组相比,8Gy IR使Psuper空载体细胞中P-P70S6K/T-P70S6K下降(1.00 vs 0.43),却对ATMRi细胞(0.43 vs 0.34)和MAPK14Ri细胞(0.32 vs 0.33)的m TOR信号通路活性没有影响。提示KU55933抑制ATM磷酸化,沉默ATM基因和沉默MAPK14基因可以部分解除Hela细胞中IR对m TOR信号通路活性的抑制。与假照组相比,8Gy IR处理H1299细胞后,AKT,P-m TOR和P-P70S6K表达水平分别下降50%,84%和70%,经700n M KU55933预处理后,各基因分别下降了10%,40%和38%。H1299沉默细胞模型中,与假照组相比,8Gy IR使Psuper空载体细胞m TOR表达水平下降62%,却没有改变ATMRi细胞的m TOR水平。重要的是,MAPK14Ri细胞中m TOR基础水平较低,为空载体对照组的0.3倍,而8Gy IR使其显著增加至0.7倍,该变化与H1299细胞中MAPLC3的变化趋势一致。表明KU5593抑制ATM磷酸化,沉默ATM基因和沉默MAPK14基因可以部分减弱H1299细胞中IR对m TOR信号通路的抑制作用。两种细胞中结果共同提示ATM和MAPK14可能通过m TOR信号通路直接调控IR诱导的自噬。8.抑制ATM和MAPK14影响Beclin 1/PI3KIII复合物Hela细胞中,8Gy IR使空载体对照组细胞Beclin 1/PI3KIII结合增加1.63倍,而在ATMRi细胞(2.93 vs 1.36)和MAPK14Ri细胞(1.99 vs 1.09)中IR使该结合水平下降。同时,在空载体细胞中检测到Beclin 1/ATM的结合,沉默ATM和MAPK14后该结合消失。另外,8Gy IR使空载体细胞中MAPK14/BCL2结合水平和MAPK14/Beclin1结合水平增加,而沉默ATM和MAPK14基因后两种结合作用分别下降和不变。提示ATM和MAPK14可能通过影响Beclin 1/PI3KIII复合物参与调控IR诱导的自噬。H1299细胞中,8Gy IR使Beclin 1/PI3KIII结合增加29.05倍,而700n M KU55933预处理后,8Gy IR不再增加Beclin

1/PI3KIII结合。另外,在空载体细胞中发现Beclin1/P-MAPKAPK2的结合,但IR不能改变二者结合水平。而沉默ATM后IR使该结合水平显著下降,沉默MAPK14后二者结合消失。Beclin1/T-MAPKAPK2结合水平也发生类似变化。进一步提示ATM和MAPK14可能通过调控Beclin 1/PI3KIII复合物增加IR诱导的自噬。结论:1.IR诱导Hela细胞和H1299细胞发生自噬及活化ATM。2.MAPK14是ATM下游底物之一。3.沉默ATM-MAPK14通路抑制IR诱导的自噬。4.沉默ATM-MAPK14通路减弱IR对m 哪里 CB-839 TOR通路的抑制作用从而降低IR诱导的自噬。5.沉默ATM-MAPK14通路影响Beclin1/PI3KIII复合物活性从而降低IR诱导的自噬。6.ATM-MAPK14通路通过m TOR信号通路和Beclin1/PI3KIII复合物调控IR诱导的自噬最终影响肿瘤细胞放疗敏感性。
重金属镉存在广泛、半衰期长、危害严重,可在人体长期蓄积,损伤神经系统、侵害心血管系统、抑制免疫功能、影响内分泌系统、具有生殖毒性、对骨骼系统更深具影响,其骨骼毒性作用机理亟待进一步深入研究和解析。体内外研究证实,镉可引起多种细胞损伤和凋亡,且凋亡与氧化应激、胞内钙稳态、线粒体损伤、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)及非Caspase依赖性通路的激活密切相关。本研究以体外培养的孕18d

SD大鼠胎鼠成骨细胞为模型,通过体外试验探讨了镉对大鼠成骨细胞的毒性损伤效应及其凋亡可能的作用机理,为进一步认识镉的骨骼毒性作用提供依据。 1.镉对大鼠成骨细胞的毒性损伤及NAC的保护效应 采用二次酶消化法获得孕18d SD大鼠胎鼠成骨细胞,经鉴定后,用0、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10、20μmol/L的醋酸镉染毒,通过cck-8还原法和细胞实时监控测定0-48h内染镉细胞存活率、细胞指数及LDH酶活性；染毒时加入0、100、500μmol/L、1、2mmol/LNAC,研究镉对大鼠成骨细胞的毒性损伤及NAC的保护作用,同时筛选作用浓度。 结果表明,随着染镉浓度的增大,成骨细胞的存活率逐渐减少,呈剂量效应关系,且具有差异显著性(P<0.05、P<0.05、P<0.01);NAC可以显著提高细胞存活率、降低LDH释放率(P<0.05、P<0.05),随后急剧降低(P<0.01)、极显著缓解了GR降低趋势(P<0.01)、极显著提高GSH含量(P<0.01)、极显著缓解了ROS降低趋势(P<0.05、p0.05),且对细胞凋亡形态和数量也无显著影响,说明在镉致成骨细胞凋亡的过程中,Caspase途径被激活,同时很可能启动了非Caspase途径。 5.钙离子途径在镉致大鼠成骨细胞凋亡中的作用 钙稳态失衡是细胞凋亡中的普遍现象。本研究在进行成骨细胞染镉的同时添加钙离子抑制剂Bapta-AM,通过观察细胞与细胞核形态变化、测定细胞内钙离子浓度、细胞存活率、细胞活性氧水平和线粒体膜电位,流式细胞仪测定凋亡率,探讨钙稳态失衡对镉引起成骨细胞凋亡的影响。 结果显示,镉可致成骨细胞内钙离子浓度极显著升高(P<0.